趙偉，陳晨，金德才，彭娟花，劉倩，周洪波

(中南大學 資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083)

在紡織工業(yè)中，織物的經(jīng)紗在織造前大都先經(jīng)過淀粉漿液的漿洗。漿料在染整過程中會影響織物的潤濕性，并阻礙化學品對纖維接觸，消耗過多的染化料，因此，織物一般都要進行退漿。工業(yè)上傳統(tǒng)的堿退漿、酸退漿及熱水退漿法，退漿效率低，易損傷織物，且工序復雜，排出大量廢液對環(huán)境產(chǎn)生很大污染。在社會對環(huán)境問題越來越重視的今天，生物酶制劑因能夠有效、經(jīng)濟、環(huán)保地進行退漿而逐漸被應用于生產(chǎn)[1-2]。退漿酶是一種生物化學催化劑，常用的有胰淀粉酶和細菌淀粉酶。這2種酶的主要組成都是α-淀粉酶，它能促使淀粉長鏈分子的α-1，4葡萄糖苷鍵斷裂，生成糊精和麥芽糖，從而極易從織物上洗除。根據(jù)熱穩(wěn)定性不同，淀粉酶可以分為普通淀粉酶和耐高溫淀粉酶。在紡織應用過程中，耐高溫的α-淀粉酶更適合工藝控制、連續(xù)化退漿生產(chǎn)的要求。產(chǎn)耐高溫 α-淀粉酶的菌種有許多，研究和應用較多的是芽孢桿菌屬(Bacillus)[3]、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheninformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等。國外生產(chǎn)高溫淀粉酶所用菌株多數(shù)是芽孢桿菌屬，但是，所用菌株產(chǎn)酶性能并不相同，應用于造紙、釀酒、紡織等不同行業(yè)的生產(chǎn)。另外，也有關于嗜熱細菌和古菌的研究[4]，不過它們最適生長溫度較高，多在80 ℃以上，生長條件較苛刻，并不適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，常溫菌株芽孢桿菌屬(Bacillus)仍然是研究的重點。本文作者從枯草堆、農(nóng)田積肥、下水道等處土樣中分離得到1株能向胞外分泌耐高溫α-淀粉酶的菌株，經(jīng)鑒定為枯草芽胞桿菌，命名為Bacillus subtilis C1，并對該菌篩選鑒定過程及所產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶酶學性質(zhì)進行研究。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

從枯草堆、農(nóng)田積肥、下水道等處，按“五點取樣法”采取土樣10份，從中分離菌株。

1.2 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基(100 mL)：蛋白胨 1 g，可溶性淀粉1 g，酵母粉 0.5 g，NaCl 1 g，pH=7。

篩選培養(yǎng)基[5]：在基礎培養(yǎng)基的基礎上，加入2%的瓊脂粉，0.01%的曲利本藍。

1.3 菌種初篩

[6]中的方法，將少量樣品放入烘箱，在80 ℃加熱處理 20 min后，稱取樣品 5 g加入裝有45 mL無菌水的小三角瓶中，靜置10 min，取上清液0.1 mL梯度(10-5，10-4，10-3)稀釋后涂布于分離篩選平板上，在45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，測量D/d(水解圈直徑/菌落直徑)[7]，挑選比值較大的進行劃線純化。將分離得到的菌株進一步劃線分離純化。

1.4 菌種復篩

將初篩得到的幾株菌純化后，在45 ℃進行液體發(fā)酵，取發(fā)酵液離心后收集上清液進行酶活測定，選取酶活高的菌株進行劃線傳代培養(yǎng)，再測定酶活，最終得到1株產(chǎn)酶穩(wěn)定且有較高酶活的耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌株。純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃保藏。

1.5 酶制備

1.5.1 粗酶液制備

用三角瓶(250 mL)裝培養(yǎng)基 100 mL，接種后于45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h 后，取發(fā)酵液在4 ℃以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 固體粗酶制備

采用冷乙醇沉淀法制備固體粗酶。在冰鹽浴中，向粗酶液中緩慢加入等體積的預冷至4 ℃的無水乙醇，并不斷攪拌，然后，在4 ℃靜置4 h。在4 ℃時，將懸濁液10 000 r/min離心20 min。棄上清，沉淀，于-20 ℃保藏過夜。于次日冷凍干燥6 h，即得固體粗酶。

1.6 酶活測定方法

采用Yoo改良法測定酶活[8-9]。在20 mL試管中加入5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液(用pH=6磷酸鹽緩沖液新鮮配制)，在70 ℃預熱10 min。然后，加入稀釋一定倍數(shù)的0.5 mL酶液，在70 ℃準確反應5 min后，加入5 mL 0.1 mol/L HCl終止反應。取0.5 mL反應液加入盛有5 mL 0.4 mmol/L I2-KI溶液的試管中顯色。在波長為620 nm時測定吸光度。酶活力單位定義為：在pH=6、溫度70 ℃、5 min水解1 mg可溶性淀粉所需的酶量為1 U。

1.7 菌株鑒定

依據(jù)文獻[10]和[11]進行生理生化鑒定。

離心收集菌體，使用UNIQ-10柱式基因組抽提試劑盒(Sangon)提取基因組DNA，以其作為擴增模板在PCR儀上進行16S rDNA擴增，所用引物以及PCR程序見文獻[12-14]。PCR產(chǎn)物采用 E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(OMEGA)純化回收后測序由北京三博遠志生物公司完成。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

將土樣梯度稀釋后，涂布在篩選培養(yǎng)基上，在45 ℃培養(yǎng)48 h后，共長出23個菌落，菌體形狀及菌落外觀如圖1所示。分別測量各個菌落的水解圈直徑D和菌落直徑d，挑出D/d較大的10個菌落，進行復篩。在基礎培養(yǎng)基中，于45 ℃培養(yǎng)72 h，測定酶活。其中：C1菌株發(fā)酵液酶活最高為185 U/mL。將其進行純化培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后，接入斜面培養(yǎng)基，于4 ℃保藏。

菌株 C1平板培養(yǎng)菌落白色或微黃色，剛形成的菌落邊緣整齊，表面光滑、黏稠，能拉絲。但超過一定的培養(yǎng)時間時，表面變得不光滑，有褶皺，邊緣不整齊，中央突起，或呈火山口狀。液體靜置培養(yǎng)時表面會形成白色菌膜。鏡檢菌株為直桿狀，2個或多個相連，單個細菌較少見。菌體兩端為圓形，端生鞭毛，有運動性。中生芽孢，呈橢圓或柱狀，不明顯膨大。菌株C1的生理生化鑒定結果如表1所示。

表1 菌株C1的生理生化特性測試結果Table 1 Physiology and biochemical characteristics of strain C1

將測得的菌株C1的16S rDNA核苷酸序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對[15]，結果顯示菌株C1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性都達到99%。利用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA 4.0構建菌株C1的系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，見圖2。

根據(jù)菌株C1生理生化及分子生物學的鑒定結果，初步斷定菌株 C1為 1株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

圖2 依據(jù)16S rDNA基因序列構建的菌株C1和相關菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of C1 and related bacterial species,constructed according to 16S rDNA gene sequence with MEGA4.0 software

2.2 生長曲線與產(chǎn)酶曲線

從冷凍斜面培養(yǎng)基上取樣接種于基礎培養(yǎng)基，在45 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)液接種于基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)80 h。每4 h取樣1次，測定細菌濃度(用c表示)及培養(yǎng)液酶活(培養(yǎng)12 h后測定酶活)，細菌生長曲線及產(chǎn)酶曲線如圖3所示。

由圖3可以看出：菌株C1的生長曲線和產(chǎn)酶曲線并不一致，產(chǎn)酶曲線略遲滯于生長曲線；0～4 h為細菌的生長延遲期，4～24 h為對數(shù)生長期，24～40 h細菌濃度保持穩(wěn)定，為穩(wěn)定期。穩(wěn)定期后，由于細菌繁殖越來越慢，菌體自溶，死亡數(shù)越來越多，細菌進入了衰亡期。從產(chǎn)酶曲線可以看出：在細菌生長12 h后，檢測到了酶活，在細菌生長進入穩(wěn)定期后，酶活開始大幅度增加；在細菌生長進入衰亡期時，酶活并沒有立刻下降，而是繼續(xù)增加，于68 h酶活達到峰值，之后由于細菌的生長代謝衰退，加上細菌分泌的蛋白酶酶解，淀粉酶酶活開始下降[17]。

圖3 菌株C1培養(yǎng)過程中的生物量及其相應淀粉酶活變化Fig.3 Variations in biomass of Strain C1 and amylase activity during incubation

2.3 C1菌株所產(chǎn)粗酶性質(zhì)

菌株C1在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，取發(fā)酵液制得一定量固體粗酶，并對其化學性質(zhì)(溫度和pH值對酶活的影響、酶的熱穩(wěn)定性)進行研究[18-19]。

2.3.1 溫度對酶活的影響

將粗酶稀釋一定濃度，在溫度40～70 ℃，每10 ℃為一梯度，分別測得粗酶酶活(a)。結果如圖4所示。

圖4 溫度對C1產(chǎn)酶酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on activity of amylase

從圖4可以看出：在較低溫度時，酶活很低，如在40 ℃時，酶活只有最高酶活的75%；隨著溫度的升高，酶促反應速度增加，酶活增大；在70 ℃時，酶活最高；而隨著溫度繼續(xù)升高，高溫減弱了酶的一些氫鍵、離子鍵、靜電相互作用等，酶的三維構象受到破壞，所以，酶活開始下降，至90 ℃時，酶活下降為峰值的94%?？梢姡?0 ℃為酶的最適溫度，而酶在較高溫度(60～90 ℃)時，酶活變化不大，比較適合紡織工業(yè)高溫退漿的需要。

2.3.2 pH值對酶活的影響

配制不同pH值(4～10)的緩沖液，將粗酶稀釋至一定倍數(shù)，在最適溫度下，測定不同pH值條件下C1產(chǎn)酶酶活(a)，結果如圖5所示。

圖5 pH值對C1產(chǎn)酶酶活的影響Fig.5 Effect of pH on activity of amylase

α-淀粉酶作為蛋白質(zhì)，也具有兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，在溶液中可以發(fā)生解離作用。酶活性中心功能基團的解離狀態(tài)隨溶液的 pH值改變而改變，因此，溶液的H+濃度對酶催化反應的速度有明顯的影響。酶分子的活性部位上的酸性或堿性氨基酸的側鏈基團，隨著pH值的變化而發(fā)生解離，酶的三維結構也隨之改變，從而影響到酶的活化以及酶與底物的親和力，宏觀表現(xiàn)為酶活的改變。從圖5可以看出：當pH值為6時，酶活最高，是酶的最適pH值；在偏酸環(huán)境中(pH=5～7)，酶活變化不大；而在堿性環(huán)境中，酶活下降較快。因此，在退漿過程中，要保持反應液的偏酸環(huán)境。

2.3.3 熱穩(wěn)定性

將粗酶分別在70，80和90 ℃保溫，分別取10，20，30，40，50和60 min時的酶稀釋一定濃度，進行酶活測定。以未經(jīng)過保溫的酶的活性為 100%，計算在不同條件下的酶活(見圖6)，確定酶的熱穩(wěn)定性。酶退漿工藝是先把棉布浸泡在65～75 ℃的熱水中，使淀粉漿料溶脹以利于酶對淀粉的作用，再浸泡到酶液中，酶液溫度為50～70 ℃。然后，堆置2～4 h，或者將軋過酶液的織物放到水浴振蕩器中或打卷后放到水浴振蕩器中，汽蒸(100 ℃左右)一定時間，再充分水洗。工藝要求酶要有較強的熱穩(wěn)定性。

圖6 酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of amylase

從圖6可知：該酶有較強的熱穩(wěn)定性，能滿足工藝的需要，在70 ℃保溫1 h，酶活下降約19%；在80℃下保溫1 h，酶活下降約38%；在90 ℃下保溫1 h后，酶活下降較大，僅為原來的42%。

3 結論

(1) 從枯草堆、農(nóng)田積肥、下水道等處土樣中篩選得到1株可以產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的細菌。通過Yoo改良法，測得酶活最高為185.6 U/mL。

(2) 通過16S rDNA鑒定，菌株C1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 的同源性都達到了99%。又由菌株C1的生理生化特性，初步鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis C1。

(3) 菌株C1在基礎培養(yǎng)基中(pH=7，溫度45 ℃)，0～4 h為細菌的生長延遲期，4～24 h為對數(shù)生長期，在24～40 h時細菌濃度保持穩(wěn)定，為穩(wěn)定期，之后進入衰亡期。細菌生長12 h后，檢測到了酶活，在細菌生長進入穩(wěn)定期后，酶活開始大幅度增加，在68 h時酶活達到峰值，之后由于細菌的生長代謝衰退，加上細菌分泌的蛋白酶酶解，α-淀粉酶酶活開始下降。

(4) C1菌株所產(chǎn)酶最適溫度為70 ℃，最適pH值為6。C1所產(chǎn)酶耐熱性能良好，在高溫條件下仍可保持較高的酶活，可以基本滿足退漿工藝中的高溫要求。若要獲得純度較高的成品固體酶，還可通過超濾、萃取等下游工藝來實現(xiàn)。

參考文獻：

[1] 蒲宗耀, 陳松, 盧濤, 等. 耐堿耐溫淀粉酶性能及退漿工藝試驗研究[J]. 紡織科技進展, 2006(1): 24-26.PU Zong-yao, CHEN Song, LU Tao, et al. Study on thermo-stable amylase desizing for cotton fabric[J]. Progress in Textile Science & Technology, 2006(1): 24-26.

[2] Du G C, Liu L M, Song Z X, et al. Production of polyvinyl alcohol-degrading enzyme with Janthinobacterium sp. and its application in cotton fabric desizing[J]. Biotechnol Journal, 2007,2(6): 752-758.

[3] Sajedi R H, Manesh H N, Khajeh K, et al. A Ca-independent α-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp. KR-8104[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005,36(5/6): 666-671.

[4] Bertoldo C, Antranikian G. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria[J]. Curr Opin Chem Biol,2002, 6(2): 151-160.

[5] 馬向東, 馬立新, 薛征峰, 等. 一種鑒定α-淀粉酶活性及其產(chǎn)生菌的新方法[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2000, 19(5): 456-460.MA Xiang-dong, MA Li-xin, XUE Zheng-feng, et al. A new method to identify α-amylase activity and its producing bacteria[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2000,19(5): 456-460.

[6] 李江華, 房峻. 真菌 α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及其固態(tài)發(fā)酵條件的初步研究[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 373-378.LI Jiang-hua, FANG Jun. Preliminary study on screening fungal α-amylase-producing strain and its solid-state fermentation conditions[J]. Food Science, 2007, 28(11): 373-378.

[7] 陳龍然, 袁康培, 馮明光, 等. 一株產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產(chǎn)酶條件及酶學特性[J]. 微生物學報, 2005, 45(1): 97-101.CHEN Long-ran, YUAN Kang-pei, FENG Ming-guang, et al.Breeding, optimized fermentation and enzymatic properties of a Bacillus licheniformis mutant producing cyclomaltodextrin glucanotransferase[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(1):97-101.

[8] Yoo Y J, Hong J, Hatch R T. Comparison of α-amylase activities from different assay methods[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1987, 30(1): 147-151.

[9] 史永昶, 姜涌明. 五種 α-淀粉酶測活方法的比較研究[J]. 微生物學通報, 1996, 23(6): 371-373.SHI Yong-chang, JIANG Yong-ming. Comparision of five methods for the assaying of α-amylase activity[J]. Microbiology,1996, 23(6): 371-373.

[10] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 8版. 洪俊華, 譯. 北京: 科學出版社, 1984: 732-735.Buchanan R E, Gibbons N E. Bergey’s manual of determinative bacteriology[M]. 8th ed. HONG Jun-hua, trans. Beijing: Science Press, 1984: 732-735.

[11] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 62-65.DONG Xiu-zhu, CAI Miao-ying. Familiar bacilli system identify enchiridion[M]. Beijing: Science Press, 2001: 62-65.

[12] Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697-703.

[13] YANG Yu, DIAO Meng-xue, SHI Wu-yang, et al. Isolation and characterization of organic-sulfur degradation bacterial strain[J].Journal of Central South University of Technology, 2007, 14(3):324-329.

[14] 丁建南, 朱若林, 康健, 等. 喜溫嗜酸硫桿菌YN12菌株的鑒定及其鎘抗性能[J]. 中國有色金屬學報, 2008, 18(2): 342-348.DING Jian-nan, ZHU Ruo-lin, KANG Jian, et al. Identification and cadmium (Ⅱ) resistance of strain YN12, Acidithiobacillus caldus[J]. The Chinese Journal of Nonferrous Metals, 2008,18(2): 342-348.

[15] Altschul S F, Gertz E M, Agarwala R, et al. PSI-BLAST pseudocounts and the minimum description length principle[J].Nucleic Acids Research, 2009, 37(3): 815-824.

[16] Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics, 2004, 5(2): 150-163.

[17] 唐欣昀, 溫崇慶. 枯草桿菌(Bacillus subtilis)蛋白酶突變株蛋白酶和 α-淀粉酶合成的關系[J]. 工業(yè)微生物, 2003, 33(2):19-22.TANG Xin-yun, WEN Chong-qing. Relations between protease and α-amylase synthesis in protease mutants of Bacillus subtilis[J]. Industrial Microbiology, 2003, 33(2): 19-22.

[18] Asgher M, Asad M J, Rahman S U, et al. A thermostable alpha-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing[J]. Journal of Food Engineering,2007, 79(3): 950-955.

[19] de Carvalho R V, Correa T L R, da Silva J C M, et al. Properties of an amylase from thermophilic Bacillus sp[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2008, 39(1): 102-107.