方 翔,丁建東,李開(kāi)如,姚玉宇,陶紹玉,王 點(diǎn),馬根山

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇南京,210009;2.安徽醫(yī)科大學(xué)滁州臨床學(xué)院,安徽滁州,239000)

心臟的發(fā)育過(guò)程是在多種轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合物的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的。這些復(fù)合物包括了超過(guò)20種不同的轉(zhuǎn)錄因子,研究最多的有Nkx2.5、GATA-4、MEF-2,t-box 等轉(zhuǎn)錄因子[1]。其中Nkx2.5是影響心臟發(fā)育的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子之一。Nkx2.5特異性表達(dá)于心房、心室、肌小梁等處的心肌組織[2],在心臟發(fā)育和保持出生后心臟穩(wěn)態(tài),特別是心臟功能成熟以及工作心肌和心臟傳導(dǎo)的功能維持等方面起到非常重要的作用。

本課題組在前期研究中首次在國(guó)人散發(fā)性先天性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)kx2.5基因外顯子1的第239位發(fā)生了A-G的突變,等位基因的突變頻率在先心病患者與正常人之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。為了深入研究轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5在先天性心臟病發(fā)病過(guò)程中的作用,本研究構(gòu)建含有Nkx2.5的真核表達(dá)載體,并將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)行為的改變,為后續(xù)的研究奠定一定的基礎(chǔ)?，F(xiàn)就此質(zhì)粒構(gòu)建方法報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA連接酶Buffer購(gòu)自Takara公司;超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒購(gòu)自Vitagene公司;柱離心式膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司;溴化乙錠(EB)購(gòu)自上海生工生物工程公司;質(zhì)粒pCMV6-XL5-Nkx2.5和pCMV-HA載體購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5-α由本研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì):參照 Nkx2.5基因序列(Genebank NO.NC_000005.9)的編碼區(qū),利用Primer3軟件設(shè)計(jì)上游引物和下游引物,上游引物引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn),下游引物引入XholⅠ酶切位點(diǎn),且使其讀碼框與pCMV-HA多克隆位點(diǎn)讀碼框一致,由上海生工公司合成。上游引物:5′-CCGGAATTCCGATGTTCCCCAGCCCTGCTC-3,(下劃線為EcoRⅠ位點(diǎn)),下游引物:5′-CCG CTCGAG CTACCAGGCTCGGATACCATG-3'(下劃線為XholⅠ位點(diǎn))。

1.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因:以質(zhì)粒pCMV6-XL5-Nkx2.5為模板,擴(kuò)增Nkx2.5編碼區(qū)序列。反應(yīng)體系為:Taq 酶 0.5 μ L,10×Taq Buffer(含MgCl2)5 μ L,dNTP 2 μ L,Template 2 μ L, 上游引物 1 μ L, 下游引物 1 μ L,dd H2O 38.5 μ L, 共計(jì)50 μ L。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃30 s,60℃40 s,72℃1 min;72℃10 min,共計(jì)30個(gè)循環(huán)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物膠的回收、連接及轉(zhuǎn)化:將PCR的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收目的基因的DNA片段,回收產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切,與同樣經(jīng)過(guò) EcoRⅠ和 XholⅠ雙酶切的pCMV-HA載體以T4連接酶16℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌,接種LB平板(AMP 100 mg/L),37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑選幾個(gè)較大的周?chē)鷽](méi)有雜菌的白色菌落,接種于液體LB培養(yǎng)基(AMP 100 mg/L),37℃、160 r/min振蕩過(guò)夜。超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒,利用PCR及限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切后送上海上海英俊生物公司測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 引物設(shè)計(jì)

成功的設(shè)計(jì)出上下游引物,擴(kuò)增出目的基因。通常PCR引物的長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基,GC含量應(yīng)在40%～60%,堿基C和G在整個(gè)引物中應(yīng)均勻分布。應(yīng)避免在引物的3′末端超過(guò)3個(gè)C或G,因?yàn)檫@樣有可能增加非特異性引物。同時(shí)在兩端可以設(shè)計(jì)不同的兩個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)(克隆載體上也應(yīng)有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)),這樣除了可以定向插入之外,還具有無(wú)外源DNA片段插入的線性載體分子自身再連接問(wèn)題。

2.2 PCR擴(kuò)增Nkx2.5基因片段

將Nkx2.5片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在GIS凝膠系統(tǒng)中檢測(cè),出現(xiàn)Nkx2.5片段的條帶(約1 kb),結(jié)果見(jiàn)圖1,PCR擴(kuò)增出的片段大小與Nkx2.5片段的理論大小一致,膠回收約1 kb大小片段(圖1)。

圖1 Nkx 2.5的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 Nkx2.5基因片段克隆至pCMV-HA載體

將Nkx2.5基因克隆至pCMV-HA載體,陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定,切出約3.8kb的載體帶和約1kb的片段(圖2),初步推測(cè)Nkx2.5已經(jīng)克隆到pCMV-HA載體。將陽(yáng)性克隆送上海生工公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,pCMV-HA-Nkx2.5構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pCMV-Ha-Nkx2.5的酶切鑒定電泳圖

3 討 論

人類(lèi)Nkx2.5基因,亦稱(chēng)心臟特異性同源盒基因(cardiac specific homebox,CSX),是一類(lèi)同源盒轉(zhuǎn)錄因子,它位于人類(lèi)染色體5q34-35,總長(zhǎng)度為 3125bp,有2個(gè)外顯子,cDNA全長(zhǎng) 1015 bp,編碼含324個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),是NK型同源盒基因家族中NK2型成員之一。人類(lèi)Nkx2.5基因蛋白同源結(jié)構(gòu)域HD含有高度保守的60個(gè)氨基酸殘基,是與 DNA結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)[4]。Nkx2.5在心臟前體細(xì)胞的分化、心臟的環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)形成以及成熟心臟正常功能的維持中起到重要的調(diào)節(jié)作用[5]。Nkx2.5是胚胎發(fā)育過(guò)程中的早期標(biāo)志之一,在胚胎發(fā)育的7.5天即表達(dá)于心臟中胚層[6]。在心臟發(fā)育過(guò)程中,Nkx2.5最初見(jiàn)于心臟頭褶期心肌源性前體細(xì)胞,持續(xù)表達(dá)于心肌細(xì)胞分化階段,隨后在胚胎、胎兒和成體心肌細(xì)胞中保持一定的表達(dá)水平。該基因一旦發(fā)生突變可引起先天畸形,如房間隔缺損(atrial septal defect,ASD)、室間隔缺損(ventricular septal defect,VSD)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus,PDA)、肺動(dòng)脈瓣狹窄(pulmonary stenosis,PS)等。

研究證實(shí)Nkx2.5在心臟發(fā)育過(guò)程參與心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(myocyte enhancer factor,MEF)等基因的表達(dá),ANP和MEF2能促進(jìn)心臟發(fā)育時(shí)心肌細(xì)胞調(diào)亡,Nkx2.5基因突變后能上調(diào)這些調(diào)亡基因高表達(dá),使發(fā)育的心肌細(xì)胞過(guò)度調(diào)亡,導(dǎo)致先天性心臟病[7]。Nkx2.5在心臟發(fā)育過(guò)程中與其他轉(zhuǎn)錄因子如 GATA-4、SRF 、Tbx-5、Tbx-2 、dHAND/HAND2等相互作用而調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育[8]。小鼠的Nkx2.5基因啟動(dòng)子包含兩個(gè)GATA結(jié)合域,其與GATA結(jié)合后對(duì)于胚胎形成早期的心臟、咽和脾的發(fā)育是必需的[9]。許多研究表明,GATA-4和Nkx2.5在蛋白質(zhì)水平相互作用調(diào)節(jié)ANP、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone mrphogenic protein,BMP)和心臟限制性錨蛋白復(fù)制蛋白等啟動(dòng)子的表達(dá)[10]。

本研究首先以質(zhì)粒pCMV6-XL5-Nkx2.5為模板,設(shè)計(jì)上下游引物成功擴(kuò)增出Nkx2.5的編碼序列,經(jīng)雙酶切后與真核表達(dá)載體pCMV-HA連接,經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定,表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-Nkx2.5。在后續(xù)的研究中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠心肌細(xì)胞中,觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)行為的改變。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有成功構(gòu)建Nkx2.5重組表達(dá)質(zhì)粒的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5在心臟發(fā)育以及先天性心臟病的發(fā)生過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

[1]Wang Y,Morishima M,Zheng M,et al.Transcription factors Csx/Nkx2.5 and GATA4 distinctly regulate expression of Ca2+channels in neonatal rat heart[J].J Mol Cell Cardiol,2007,42(6):1045.

[2]汪 劍,卓莉莉,姜之文,等.CSX/Nkx2.5基因在大鼠胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,28(5):605.

[3]丁建東,李開(kāi)如,張曉黎,等.轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5基因突變與先天性心臟病相關(guān)性的初步研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2009,89(16):1114.

[4]Vincentz J W,Barnes R M,Firulli B A,et al.Cooperative interaction of Nkx2.5 and Mef2c transcription factors during heart development[J].Dev Dyn,2008,237(12):3809.

[5]方 翔,丁建東.轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5與GATA-4在心臟發(fā)育中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2009,15(22):3366.

[6]Raffin M,Leong L M,Rones M S,et al.Subdivision of the cardiac Nkx2.5 expression domain into myogenic and nonmyo2genic compartments[J].Dev Biol,2000,218(2):362.

[7]Zhu W,Shiojima I,Hiroi Y,et al.Functional analyses of three Csx/Nkx2.5 mutations that cause human congential heart disease[J].J Biol Chem,2006,275(45):35291.

[8]Akazawa H,Komuro I.Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5:Its role in cardiac development and diseases[J].Pharmacol Ther,2005,107(2):252.

[9]Lien C L,Wu C,Mercer B,et al.Control of early cardiacspecific transcription of Nkx2-5 by a GATA-dependent enhancer[J].Development,1999,126(1):75.

[10]McBride K,Nemer M.Regulation of the ANF and BNP promoters by GATA factors:lessons learned for cardiac transcription[J].Can J Physiol Pharmacol,2001,79(8):673.