林 靜 趙 今 朱 明 李新尚

齲病是人類口腔最常見的細(xì)菌感染性疾病。變形鏈球菌(Streptococcus mutans，簡稱變鏈菌)是公認(rèn)的主要致齲菌群，其代謝過程中產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltrans-ferases，GTFs)介導(dǎo)變鏈菌對牙面的粘附[1]，在牙菌斑生物膜的形成和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性能抑制病理性牙菌斑生物膜的形成，從而預(yù)防齲病及其他生物膜相關(guān)性疾病。牙菌斑生物膜是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，生物膜對宿主防御系統(tǒng)的抵抗力、耐受性強(qiáng)；對抗生素的敏感性降低；具有空間和環(huán)境的多樣性；能表達(dá)不同于浮游細(xì)菌的表型。因此防齲藥物的研究需從對浮游細(xì)菌和細(xì)菌生物膜兩方面進(jìn)行研究，才能從本質(zhì)上闡明藥物防齲的作用機(jī)制。

研究表明沒食子鞣質(zhì)(Aleppo Gall)可以抑制口腔細(xì)菌對羥基磷灰石的粘附[2]，并且能夠改變牙菌斑生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低生物膜密度及調(diào)整生物膜內(nèi)部死活菌的比例[3]，對GTF活性的作用仍待驗(yàn)證。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，沒有系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評估藥物對不同狀態(tài)變鏈菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響，因此，本研究采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，比較沒食子鞣質(zhì)、氟化鈉、沒食子聯(lián)合氟化鈉對細(xì)菌浮游狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下GTF酶活性的影響，探討實(shí)驗(yàn)藥物防齲的作用機(jī)制。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)藥物：用含2%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基將沒食子鞣制配制成4mg/ml的溶液，氟化鈉配置為50mg/l的溶液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及菌懸液的制備：變形鏈球菌ATCC 25175購買于四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。將復(fù)蘇48h后的細(xì)菌接種于腦心浸液(brain-heart infusion，BHI)液體培養(yǎng)基中，37℃下厭氧培養(yǎng)24h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水調(diào)菌濃度在540nm波長處吸光度OD值為1.0的菌懸液(3×108CFU·ml-1)備用。

1.1.3 主要儀器及試劑：厭氧盒(日本三菱株式會社)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司DNP-9162)，厭氧指示劑(法國梅里埃OC466922-96118)，厭氧發(fā)生劑(法國梅里埃REF-96124)，標(biāo)準(zhǔn)6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，超濾離心管，標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板，固體硫酸銨，考馬斯藍(lán)G-250，牛血清白蛋白(Sigma，美國)，葡聚糖，磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L pH 6.0)，蔥酮試劑：200mg蔥酮加入100ml濃硫酸中攪拌溶解。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)研究目的采用三因素兩水平(2×2×2)析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)。三個(gè)因素分別為變形鏈球菌(A)，實(shí)驗(yàn)藥物沒食子(B)，對照藥物氟化鈉(C)。每一個(gè)因素有兩個(gè)水平，變形鏈球菌有浮游(A1)和生物膜(A2)培養(yǎng)兩個(gè)水平，藥物沒食子有干預(yù)(B1)和不干預(yù)(B2)兩個(gè)水平，氟化鈉也有干預(yù)(C1)和不干預(yù)(C2)兩個(gè)水平，將三個(gè)因素的兩個(gè)水平進(jìn)行排列組合，交叉分組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為8組：

每組7個(gè)平行樣本(樣本含量的計(jì)算根據(jù)析因?qū)嶒?yàn)把υe≥12作為實(shí)驗(yàn)精度的最低要求，計(jì)算得到每組7個(gè)平行樣本，樣本總數(shù)為56。)

1.2.3 不同狀態(tài)細(xì)菌的培養(yǎng)

浮游狀態(tài)組：將制備好的菌懸液1ml接種于5mlBHI液體培養(yǎng)基混勻，置于50ml滅菌離心管內(nèi)(蓋緊瓶蓋)放入搖床，300rmp·h-1，37℃下培養(yǎng)24h增菌。

生物膜狀態(tài)組：將8×8cm無菌蓋玻片置于6孔細(xì)菌培養(yǎng)皿，加入菌懸液1ml和5mlBHI液體培養(yǎng)基混勻，放入?yún)捬鹾?7℃下培養(yǎng)24h形成生物膜。

1.2.4 藥物對GTF活性的作用 依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別向每組加入制備好的實(shí)驗(yàn)藥液培養(yǎng)基，37℃下厭氧培養(yǎng)18h。粗酶提取液的制備：①生物膜組吸出六孔板內(nèi)培養(yǎng)基放人離心管內(nèi)，浮游組直接離心(3000r/min，20min)，②上清液加固體硫酸銨達(dá)60%飽和度，置于4℃冰箱24h，③再次離心(12000r/min，30min)，棄去上清液，將沉淀物用5mL磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L，pH6.0)溶解，④放入超濾離心管內(nèi)離心(10000r/min，15min)2次，棄去管底水,⑤收集濾膜管內(nèi)粗酶提取液進(jìn)行酶活性測定。

酶活性測定：取GTF粗酶0.1ml，采用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量，采用蒽酮法測定酶-底物反應(yīng)液中的還原糖量。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel，用每個(gè)樣本的還原糖量除以該樣本的蛋白含量即得到該樣本每毫克胞外GTF蛋白所還原的糖含量。GTF活力計(jì)算方法：酶活力=還原葡萄糖量×葡萄糖相對分子質(zhì)量-1×60-1。實(shí)驗(yàn)藥物對酶活性抑制率=(同水平不用藥組－藥物組)/同水平不用藥組×100%

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件包對葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行析因分析；實(shí)驗(yàn)藥物對酶活性抑制率進(jìn)行單因素方差分析。在α=0.05的情況下比較各組有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

GTF酶活性測定見表1。析因分析結(jié)果，GTF酶活性在細(xì)菌不同培養(yǎng)狀態(tài)下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),浮游狀態(tài)下GTF酶活性高于生物膜狀態(tài)；沒食子鞣質(zhì)干預(yù)和氟化鈉干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B因素與C因素間有交互作用(P＜0.05)，即沒食子鞣質(zhì)聯(lián)合氟化鈉使用有效。

實(shí)驗(yàn)藥物對GTF酶活性的抑制率見圖2，沒食子、氟化鈉、沒食子聯(lián)合氟化鈉對細(xì)菌不同狀態(tài)下GTF酶活性的抑制率有差異(P＜0.05)，浮游狀態(tài)下的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶比生物膜狀態(tài)對藥物作用敏感，沒食子的抑制作用最為顯著，抑制率沒食子＞沒食子聯(lián)合氟化鈉＞氟化鈉。

表1 實(shí)驗(yàn)藥物對變鏈菌不同狀態(tài)下GTF酶活性的影響(U)

3.討論

齲病是人類最常見的口腔疾病，對齲病防治的研究一直是口腔領(lǐng)域艱巨而重要的課題。國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了多種防齲措施的實(shí)驗(yàn)研究，如抗生素，氟化物，化學(xué)制劑，免疫防齲等。但這些方法存在諸多局限性及不足之處，因此尋找安全、有效、經(jīng)濟(jì)的防齲藥物一直是齲病研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)，天然藥物因其毒副作用小，取材方便和經(jīng)濟(jì)，在齲病防治中的作用日益受到重視。天然藥材具有明顯的地域性，沒食子作為維吾爾醫(yī)藥防齲的代表性藥物，在民間有悠久的應(yīng)用歷史，但缺乏系統(tǒng)的研究，課題組前期完成了沒食子有效成分的分離、提取、鑒定；從沒食子對口腔細(xì)菌的生長、代謝以及粘附等致齲毒力因子的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)藥物的體外防齲效能，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究沒食子鞣質(zhì)對變鏈菌GTF酶活性的作用，并探討與氟制劑聯(lián)合應(yīng)用是否有協(xié)同作用，開拓齲病防治的新途徑。

氟化物是目前公認(rèn)有效的防齲制劑[4]，但其使用具有明顯的局限性。含氟制劑的使用需要眾多專業(yè)人士指導(dǎo)和實(shí)施，耗資巨大，同本國國情極不相符，更不適合于我國西部地區(qū)齲病的群體防治。王敬[5]研究結(jié)果顯示氟濃度為50mg/L的氟化鈉制劑對變形鏈球菌GTF活性有較明顯的抑制作用。長期應(yīng)用氟化鈉可致使慢性氟中毒，耐氟菌株的產(chǎn)生則可能進(jìn)一步影響氟化物防齲的效果[6]。由于天然藥物藥效學(xué)差異大，本研究根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)[1]得到的沒食子鞣質(zhì)最低抑菌濃度(MIC)4mg/l，以50mg/L氟化鈉，以及二者聯(lián)合使用，與未用藥組對比，沒食子、氟化鈉、沒食子聯(lián)合氟化鈉對兩種狀態(tài)培養(yǎng)下的GTF活性均有抑制作用，沒食子對GTF活性的抑制率最高，聯(lián)合用藥組的抑制率低于沒食子，高于氟化鈉。GTF是一種需金屬離子激活的酶，氟性質(zhì)活潑，能通過與激活酶所需的金屬離子優(yōu)先結(jié)合，使酶構(gòu)型發(fā)生變化，從而抑制酶的活性。沒食子鞣質(zhì)不具有與氟離子競爭GTF酶上結(jié)合位點(diǎn)的作用，相互之間不存在拮抗作用，目前兩種藥物聯(lián)合作用的具體機(jī)制尚不清楚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沒食子與氟化鈉聯(lián)和使用的藥效的介于兩種藥物單獨(dú)使用之間，不能說明二者具有協(xié)同作用。沒食子鞣質(zhì)可能作用于變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性區(qū)[7],從而影響葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。

在不用藥物干預(yù)的情況下，浮游狀態(tài)下培養(yǎng)的變鏈菌較生物膜狀態(tài)培養(yǎng)的變鏈菌產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)活性高。證實(shí)了細(xì)菌在浮游狀態(tài)與生物膜狀態(tài)中葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)存在差異?？赡苁怯捎贕TF能在不同狀態(tài)下合成不同結(jié)構(gòu)的葡聚糖[8]，這種結(jié)構(gòu)的差異由鍵的組成和排列的變化造成，從浮游狀態(tài)到生物膜狀態(tài)后，α-1，3葡萄糖苷鍵和α-1，6葡萄糖苷鍵的比例有所變化。目前，防齲藥物的研制多以浮游細(xì)菌為研究對象，往往對浮游細(xì)菌非常有效的藥物卻難以對付生物膜，因?yàn)樯頎顟B(tài)下，生物膜中的細(xì)菌比浮游細(xì)菌具有更強(qiáng)的毒性、耐藥性和抵抗宿主免疫防御的能力。因此，對口腔微生物及酶的抑制研究需從浮游與生物膜兩方面進(jìn)行。

研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)藥物沒食子、氟化鈉、沒食子聯(lián)合氟化鈉對浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下培養(yǎng)的變鏈菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶均有抑制作用。浮游狀態(tài)下的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶比生物膜狀態(tài)下葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對同一濃度的同種藥物的作用敏感。黃冰冰研究發(fā)現(xiàn)[9,10]：從中藥厚樸中提取抗變鏈活性成分MO2，能降低細(xì)胞表面疏水率，抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成水不溶性葡聚糖。其質(zhì)量濃度為1.25－5.0g/L時(shí)即可抑制所有GTF的活性，其中包括牙菌斑和懸浮液中的GTF；對懸浮液中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制比對吸附在獲得性膜上的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶強(qiáng)。其機(jī)制可能是非競爭性地抑制GTF的葡聚糖結(jié)合區(qū)，同時(shí)厚樸酚作用于蔗糖的分解和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使厚樸有效抑制變鏈菌GTF酶活性。沒食子鞣質(zhì)對浮游狀態(tài)及生物膜狀態(tài)下的GTF酶活性抑制差異顯著，目前對此差異的原因尚不清楚，可能是生物膜狀態(tài)的細(xì)菌啟動了一套與浮游狀態(tài)不同的基因表達(dá)形式，從而gtfB、gtfC、gtfD基因的表達(dá)發(fā)生改變，與藥物敏感性有直接關(guān)系[11]。KooH報(bào)道稱[12]芹菜素可以抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，并能顯著降低gtfB和gtfC的表達(dá)，相反增加gtfD的表達(dá)。因此，我們還將在mRNA水平研究細(xì)菌生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)下GTF基因表達(dá)的差異，探索沒食子鞣制防齲的作用機(jī)制。

[1]張 鷹,文玲英,儲冰峰.變形鏈球菌黏附相關(guān)分子及其針對性免疫防齲的研究進(jìn)展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,8(2)：120-123

[2]趙 今,李 艷,孫玉亮等.沒食子鞣質(zhì)及有效提取物對致齲細(xì)菌粘附抑制作用[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009，32(1)：6-8

[3]趙 今,哈木拉提·吾甫爾,林 靜等.沒食子鞣質(zhì)及有效提取物對牙菌斑作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].科技導(dǎo)報(bào),2009,27(7)：24-28

[4]Louis W,Ripa.A half-century of community water fluoridation in the united states：review and commentary[J].J Public Health Dent,1993,53(3)：17-44

[5]王 敬.氟化微量元素防齲作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,2004

[6]Loreren C,Simons YM,Soet JJ,et al.Acidogenesis in relation to fluoride resistance of Streptococcus mutans[J].Oral Microbiol Immunol,1991,6(5)：288-291

[7]汪 林,儲冰峰,王成龍等.IPTG誘導(dǎo)變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶可溶性表達(dá)及活性初步測定[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,8(2)：94-97

[8]Schilling KM,Bowen WH.Infect Immun,Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans[J].Infect Immun,Jan1992,60：284-295

[9]Huang BB,Fan MW,Han DX.Effect of Magnolia Off icinal is Extract on Cariogenic Activity of Mutans Streptococci.Journal of Oral Science Research,2010,26(3)：362-365

[10]Huang BB,Fan MW,Wang SL,et al.An-glucosyltransferase meachanism of magnolol from Magnolia efficinalis.Areh Oral Biol,2006,51(10)：899-905

[11]Koo H,Xiao J,Klein MI,et al.Exopolysaccharides Produced by Streptococcus mutans Glucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies within Multispecies Biofilms[J].Journal ofBacteriology, 2010, 192(12)：3024-3032

[12]Koo H,Seils J,Abranches J,et al.Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159[J].Antimicrob Agents Chemother.2006,50(2)：542-548