張 嵐,杜亞明,王中彬

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121001)

玉竹味甘平,性微寒,含有多糖、單糖、生物堿、菸酸等成分,具有扶正固本、養(yǎng)陰潤燥之功效。研究發(fā)現(xiàn),玉竹提取物 B(EB-PAOA)具有一定的抗腫瘤作用,但作用機制尚不清楚。2009年 1月 ～2010年1月,我們觀察了 EB-PAOA對人食管癌細胞 Eca-109增殖與凋亡的影響,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109細胞,EB-PAOA,RPMI-1640培養(yǎng)液,胰蛋白酶,胎牛血清 (FBS),吖啶橙試劑(AO),噻唑藍(MTT),Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒；CO2培養(yǎng)箱,Olympus光學(xué)顯微鏡,COULTEREP ICSXL型流式細胞儀,JEM-1200EX透射電子顯微鏡和 Olympus熒光顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將 Eca-109細胞置于含 10%FBS的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天以 1∶2比例傳代 1次。細胞經(jīng)胰酶分散傳代和收獲,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 EB-PAOA對 Eca-109細胞增殖作用觀察采用 MTT法。取 Eca-109細胞,以 1×104/孔接種于 96孔板中,培養(yǎng) 24 h后換液。加入終濃度分別為 100、50、25、12.5 mg/ml的 EB-PAOA,每個濃度每個時點均設(shè) 4個復(fù)孔,設(shè)陰性對照和空白對照。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h,于終止培養(yǎng)前4 h每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml,PBS配制)20μl,繼續(xù)孵育 4 h后,吸棄上清液,加入 100μl DMSO,微孔板震蕩器上震蕩 10 min,酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度 A值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 =1-(實驗組 A值/對照組 A值)×100%

1.2.3 EB-PAOA對 Eca-109細胞凋亡作用觀察取 Eca-109細胞以 1×106/孔接種于 6孔板中,培養(yǎng)24 h后換液。加入終濃度分別為 100、50、25、12.5 mg/ml的 EB-PAOA,設(shè)不加藥對照組。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收獲細胞,用新鮮配制的 PBS(pH 7.4)3 ml洗滌 2次,1 000 r/min離心 5 min,吸棄上清,將細胞重懸于 200μl Binding Buffer,加入10μl Annexin V-FITC和 5μl PI,輕輕混勻,避光室溫反應(yīng) 15 min,加入 300μl Binding Buffer,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS12.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)進行重復(fù)測定方差分析、單因素方差分析和多重比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EB-PAOA對 Eca-109細胞增殖的影響 見表1。由表可見,EB-PAOA對 Eca-109細胞增殖有抑制作用,藥物濃度增大、作用時間延長,抑制作用越明顯,呈劑量、時間依賴性(P均 ＜0.05)。

表1 EB-PAOA對 Eca-109細胞增殖的影響(%,±s)

表1 EB-PAOA對 Eca-109細胞增殖的影響(%,±s)

EB-PAOA濃度(mg/ml)細胞增殖抑制率24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 12.5 5.62±0.31 14.14±0.81 29.92±0.97 25 8.13±0.75 18.42±1.53 33.27±2.71 50 11.75±1.80 19.53±2.21 41.32±4.87 100 16.46±1.91 24.84±3.32 53.84±5.86

2.2 EB-PAOA對 Eca-109細胞凋亡的影響 EBPAOA與 Eca-109細胞共培養(yǎng) 48 h后,EB-PAOA濃度為 0、12.5、25、50、100 mg/ml時 ,Eca-109細胞凋亡率分別為 0.45%±0.23%、8.54%±1.34%、13.43%±1.95%、29.67%±3.53%、39.69%±6.96%。統(tǒng)計結(jié)果顯示,隨著 EB-PAOA濃度增加,Eca-109細胞凋亡率逐漸增加,呈一定濃度依賴性(P均 ＜0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是多基因、多因素共同作用的結(jié)果。由于食管癌早期診斷較困難,確診時 70%～80%的患者已進入臨床中晚期,因此化療是重要的治療手段。傳統(tǒng)抗腫瘤藥在殺傷腫瘤細胞的同時也大量破壞機體的正常細胞,臨床不良反應(yīng)大。近年來研究發(fā)現(xiàn),而許多中藥都具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用,如人參皂苷可誘導(dǎo)直腸癌細胞凋亡[4],丹參酮ⅡA可誘導(dǎo) HL-60細胞凋亡[5]等；并且這種抑制作用對生物體幾乎沒有毒副作用,所以備受關(guān)注。

玉竹,別名鈴鐺菜、尾參、地管子、甜草根,是百合科黃精屬多年生草本植物,因該植物形態(tài)似竹、光瑩如玉,故名玉竹[6]。玉竹為藥食滋補兼用品,明代李時珍在總結(jié)玉竹的使用經(jīng)驗時稱,“予每用治虛勞寒熱及一切不適之癥,用代參、芪,不寒不燥,大有殊功”。潘興瑜等[7]研究發(fā)現(xiàn),EB-PAOA能抑制人 T淋巴細胞白血病細胞株 CEM的增殖,且呈明顯的時間、劑量依賴性,但對人的正常淋巴細胞沒有影響,認為其抗 CEM作用主要機制之一是誘導(dǎo) CEM細胞凋亡。李塵遠等[8]研究表明,EB-PAOA能促進宮頸癌 Hela細胞由 G0/G1期進入 S期,S期進入G2/M期,并阻滯在 G2/M期,而且隨 EB-PAOA劑量加大,這種阻滯現(xiàn)象愈明顯。這說明 EB-PAOA能通過干擾腫瘤細胞的有絲分裂,從而降低其增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)[9],EB-PAOA處理后的足墊荷 S-180肉瘤小鼠產(chǎn)生細胞因子 IL-1、IL-2、TNF-α的能力增強,提示 EB-PAOA有可能通過誘生細胞因子 IL-1、IL-2、TNF-α,提高了小鼠機體的免疫監(jiān)視功能。本研究結(jié)果顯示,隨著 EB-PAOA濃度增大、作用時間延長,Eca-109細胞的增殖抑制率逐漸增加(P均 ＜0.05)；隨著 EB-PAOA濃度增大,細胞凋亡率均逐漸增加(P均 ＜0.05)。我們認為,EB-PAOA可通過抑制 Eca-109細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,可能與 EB-PAOA干擾 Eca-109細胞的有絲分裂,從而抑制其增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。這可為開發(fā)EB-PAOA成為新型抗腫瘤中藥提供理論基礎(chǔ),但其確切機制有待于進一步研究。

[1]粟儉.藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡研究進展[J].國外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊,1995,22(1):7-9.

[2]張覃沐.抗腫瘤藥物的藥理與臨床應(yīng)用[M].鄭州:河南醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:229.

[3]林厚文,韓公明,謬時萱.中藥玉竹有效成份研究[J].藥理學(xué)報,1997,29(3):215.

[4]邢建華,陳永芹.人參皂苷誘導(dǎo)直腸癌細胞凋亡的臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,21(4):260-261.

[5]黃韌敏,袁淑蘭,宋毅,等.丹參酮ⅡA誘導(dǎo) HL-60細胞凋亡[J].癌癥,1998,17(3):164-166.

[6]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1987:58.

[7]潘興瑜,張明策,李宏偉.玉竹提取物 B對腫瘤的抑制作用[J].中國免疫學(xué)雜志,2000,16(7):460.

[8]李塵遠,劉玲,潘興瑜.玉竹提取物 B對 Hela細胞凋亡的影響[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,24(6):14-16.

[9]李塵遠,潘興瑜,張明策,等.玉竹提取物 B抗腫瘤機制的初步研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2003,19(4):253-254.