隋 慧，楊金生

（1.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.吉林省獸醫(yī)科學研究所，吉林 長春 130062）

兔出血癥（Rabbit haemorrhagic disease，RHD）是1984年由我國首先發(fā)現(xiàn)的家兔的一種烈性毀滅性病毒性傳染病，病原為RHDV。RHDV屬于杯狀病毒科兔病毒屬。RHDV基因組為單股正鏈RNA，由7437個核苷酸組成。RHDV基因組含有2個ORFs。除了基因組RNA外，RHDV還包含一個2.2 kb的亞基因組。ORF1編碼一個多聚蛋白。該多聚蛋白被病毒蛋白酶進一步分解為衣殼蛋白（65 KD）和多個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中衣殼蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，稱VP60。體外翻譯表明亞基因組也編碼VP60。VP60基因是RHDV的唯一結(jié)構(gòu)蛋白基因，在病毒的誘導機體免疫反應(yīng)中起主要作用，其核苷酸的極端保守性正是目前RHDV僅有一個血清型的原因所在，也是現(xiàn)有RHDV疫苗能提供較好保護能力的重要原因之一，同時也為科研人員研制基因工程疫苗帶來了極大的便利。VP60蛋白從N端到 C 端可分 A、B、C、D、E、F 6 個區(qū)域，西班牙學者E.Viaplana等證實了RHDV的A、B段包括最初的175個氨基酸比VP60的其它部分具有更高的抗原性，這個區(qū)域在病毒的衣殼中具有高度保護性。

1 材料與方法

1.1 材料

RHDV CD株，由遼寧省益康生物制品廠提供；反轉(zhuǎn)錄酶AMV RT、Rnasin、dNTPs、Ex Taq、 溴化乙錠（EB）、MarkerDL2000 均 為 大 連Takara公司產(chǎn)品；瓊脂糖（Agarose）為Oxoid公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒為杭州Vitagene公司產(chǎn)品；LS Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；DEPC水購自寶泰克生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

參照GenBank發(fā)表的RHDV基因序列，設(shè)計了擴增VP60主要抗原表位基因的上下游引物P1、P2。為方便后續(xù)工作，在上下游引物兩端分別加EcoRI、XhoI酶切位點，送寶泰克生物技術(shù)公司合成。

上游引物 P1：5'-ATGAATT CGAGGGCAAAGCCCG-3'

下游引物 P2：5'-ATGCTCG AGTTAGGGACGCAAGTCTGG-3'

斜體加黑部分分別為EcoRI、XhoI酶切位點，引物P1、P2使用前按照說明書將其用滅菌三餾水稀釋成工作濃度20～30 pmol/μL。

1.2.2 病毒增殖

取RHDV種毒10×稀釋后，皮下接種成年易感家兔。待家兔發(fā)病死亡后，取其肝臟搗碎，加10×無菌生理鹽水勻漿，凍融3次，10000 r/min離心10 min，取上清-20℃保存。

1.2.3 病毒RNA提取及RT-PCR

按照Trizol試劑盒方法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄設(shè)為25 μL體系，下游引物 2 μL、病毒 RNA 10 μL，置 70℃ 5 min，冰浴 5 min。加入 10 mmol/L dNTP 3 μL、5 ×AMV RT Buffer 5 μL、Rnasin 1 μL （40 U）、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μL、DEPC水 2 μL，置42℃水浴90 min，冰水浴5 min后立即進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)：模板（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）3 μL，上游引物 P1（20～30 pmol/μL）5 μL，下游引物 P2 （20～30 pmol/μL）6 μL，為dNPT （2.5 mM each）4μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，滅菌三餾水26.5 μL，Ex Taq （5 U/μL）0.5 μL。置PTC100型PCR擴增儀進行擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃35 s，50℃ 35 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將純化的PCR產(chǎn)物送Takara公司進行序列測定。

1.2.4 各RHDV株間同源性和系統(tǒng)發(fā)生分析

采用DNASTAR軟件，對14株不同地區(qū)的RHDV進行核酸及推導氨基酸同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的PCR擴增

RHDV接種易感兔后，家兔發(fā)病死亡，從兔肝組織勻漿中提取病毒RNA，采用RT-PCR方法擴增VP60主要抗原表位基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在525 bp處出現(xiàn)一條DNA帶（圖1）。

2.2 測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示，VP60主要抗原表位基因長525 bp（圖2）。

2.3 核酸序列分析

2.3.1 CD株VP60主要抗原表位基因的核酸序列分析

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因全長 525 bp，A、T、G、C 含量分別為 23.62%、22.10%、26.67%、27.62%，GC含量為54.29%。

2.3.2 毒株之間核酸的同源性比較

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因與其它13株來自中國（WX-84 AF402614、NJ AY269825、Harbin AF453761）株、法國（99-05 AJ302016、00-13 AJ495856、SD Z29514）株、墨西哥（Mexico-89 AF295785）株、意大利（BS-89 X87607）株、英國（Rainham AJ006019、Wriezen Y15427）株、西班牙 （AST-89Z49271） 株、捷克（Crech-V351U54983） 株 、 美 國（Iowa2000 AF258618） 株的 RHDV VP60同一序列進行了核苷酸序列同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD株與WX-84株同源性最高為97.5%，與其它毒株的同源性在92.0%～96.6%，其它毒株間的同源性在90.3%—99.4%（表1）。

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2.3.3 RHDV各毒株間核苷酸進化關(guān)系

如圖3所示。

2.4 毒株之間氨基酸序列比較

2.4.1 毒株之間氨基酸同源性比較

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因推導的氨基酸序列與其它13株來自中國（WX-84AF402614、NJ AY269825、Harbin AF453761） 株、法國（99-05 AJ302016、00-13 AJ495856、SD Z29514）株、墨西哥（Mexico-89 AF295785）株、意大利（BS-89 X87607）株、英國（Rainham AJ006019、Wriezen Y15427）株、西班牙（AST-89 Z49271）株、捷克（Crech-V351 U54983）株、美國（Iowa2000 AF258618）株的 RHDV VP60同一序列推導的氨基酸序列進行了同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD株與WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高，為99.4%；與其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之間，其它毒株間的同源性在96.0%～100.0%之間（表2）。

2.4.2 RHDV各毒株間氨基酸進化關(guān)系

如圖4所示。

3 討論

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RHD是二十世紀末新發(fā)現(xiàn)的一種對兔危害極大的傳染病，一開始就引起人們極廣泛的興趣。由于RHDV不能在雞胚上增殖，也難于在各種原代或傳代細胞中穩(wěn)定增殖，故至今尚未真正建立體外組織細胞的培養(yǎng)方法，所以目前廣泛使用的疫苗為組織滅活苗，即取人工感染的病兔肝臟制成勻漿，加入甲醛等滅活劑進行滅活后使用。一般采取皮下或肌肉注射接種，具有良好的免疫效果。但目前隨著家兔飼養(yǎng)成本的提高以及非免疫兔的減少，可用于制苗的感染材料日趨減少，使組織滅活苗的成本不斷增加，加之組織滅活苗本身所不可避免的種種缺點以及動物福利等[1]問題，使得研究者的目光紛紛轉(zhuǎn)向新型疫苗和診斷試劑的研制和開發(fā)，因此RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白-VP60的研究成為熱點。國外對RHD基因工程疫苗已進行了廣泛的研究，并取得了令人滿意的研究成果，在國內(nèi)只見一篇相關(guān)研究的文獻[2]報道。

RHDV核衣殼（VP60）由2個同心圓構(gòu)成，VP60的N端構(gòu)成核衣殼內(nèi)層，C端構(gòu)成核衣殼外層。VP60蛋白的氨基酸由N端到C端又可分A、B、C、D、E、F 6個區(qū)域。在T7RNA聚合酶的控制下，西班牙學者E.Viaplana等[3]在大腸桿菌中表達了RHDV衣殼蛋白-VP60的五個重疊部分（A、B、C、D、E）。經(jīng)過純化，研究了這些變性蛋白片段的抗原性，用Western blot分析，這些片段能與自然感染和疫苗接種兔的血清起反應(yīng)。在接種滅活疫苗時，制備的抗血清與片段A和B的反應(yīng)性約是C、D、E的100倍，在用其它疫苗接種時，片段A、B、C、D的抗原性得到了相似的結(jié)果，表明VP60主要抗原表位出現(xiàn)在N末端。VP60氨基末端區(qū)域包括連續(xù)的抗原決定簇，這些抗原決定簇無論是在病毒感染還是接種滅活疫苗時都能誘導免疫反應(yīng)。在自然感染動物體內(nèi)，檢測不到抗C片段的抗體，可能是因為在自然感染過程中，該區(qū)域在病毒復制過程中被埋在衣殼內(nèi)部。D段要和杯狀病毒VP60向外伸展的P1、P2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，這與杯狀病毒三維特征相一致。E段與疫苗接種動物的血清和自然感染動物的血清的反應(yīng)性都較低。研究表明重組RHDV VP60的N末端（A、B段包括最初的175個氨基酸）比VP60的其它部分具有更高的抗原性，這個區(qū)域在自然感染和疫苗接種時都具有免疫性并且該部分包括誘導免疫反應(yīng)的重要抗原決定簇。

本試驗用RHDV CD株人工感染家兔，發(fā)病死亡后，取肝臟勻漿，用Trizol試劑從勻漿上清中提取病毒RNA。根據(jù)Genbank已發(fā)表序列保守區(qū)設(shè)計并合成引物，采用RT-PCR方法擴增了RHDV衣殼蛋白VP60主要抗原表位基因。測定了其核苷酸序列，并與其它13株來自中國（WX-84、NJ、Harbin） 株、法國（99-05、00-13、SD）株、墨西哥Mexico-89株、意大利BS-89 株、英國（Rainham、Wriezen）株、西班牙AST-89株、捷克Crech-V351株、美國Iowa2000株的RHDV VP60同一序列進行了核苷酸及推導氨基酸序列的同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD株與WX-84株核苷酸序列同源性最高達97.5%，與其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之間，其它毒株間的同源性在90.3%～99.4%之間。與WX-84株、墨西哥Mexico-89株氨基酸序列的同源性最高，99.4%，與其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之間，其它毒株間的氨基酸同源性在96.0%～100.0%之間。系統(tǒng)發(fā)生樹中所表明的各毒株間的親緣關(guān)系與動物流行病學資料相符[4]。墨西哥因從中國引入冷凍兔肉而引起RHD的暴發(fā)，同年捷克也有該病流行。西班牙與法國株在同一組，可能是由于西班牙和法國在地理位置上相鄰所致。有研究報道，RHD在歐洲的暴發(fā)是同時從意大利和東歐兩個方向席卷歐洲大陸的，因此，意大利與英國株在同一組與動物流行病學資料相吻合。法國株與中國株、美國株同在一個分枝，可能與法國直接從中國輸入活兔或兔肉有關(guān)。RHDV各分離株VP60主要抗原表位基因核苷酸及推導的氨基酸序列的同源性均在90%以上，顯示出高度保守性。RHDV各分離株之間VP60基因的高度保守性是RHDV只有一個血清型的原因所在，也是目前現(xiàn)有RHDV疫苗能夠提供有效保護的原因之一[5]。本研究所克隆的VP60主要抗原表位基因，將為RHDV診斷試劑和基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。本研究所克隆的片段只是VP60的一部分，該片段是否能代表VP60乃至整個基因組，尚有待進一步研究。

[1]劉懷然，陳洪巖，關(guān)云濤，等.兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因克隆與序列分析 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2002，24（5）：322-324.

[2]嚴維巍，崔治中，王永坤.中國株兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因在大腸桿菌中的表達及其免疫原性鑒定[J].中國獸醫(yī)學報，2003，23（5）：447-449.

[3]Viaplana E，Plana J，Villaverde A.Antigenicity of VP60 structural protein of rabbit haemorrhagic disease virus[J].Arch Viol，1997，142（9）：1843-1848.

[4]Moss S R，Turner R C，Trout P J，et al.Molecular epidemiology of rabbit haemorrhagic disease virus[J].J Gen Virol，2002，83（10）：2461-2467.

[5]嚴維巍，崔治中，王永坤.兔出血癥病毒中國株衣殼蛋白基因的克隆和序列分析[J].中國病毒學，2003，18（2）：129-133.