韓凌斐 王 玲 邱偉民 姚紅霞 胡 程 卞 政馬衣努爾·買提托合提 方 勇 馬 丁△

1同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院,上海 200040

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030

T細(xì)胞的活化需要TCR識別抗原肽所提供的第一信號和共刺激分子所提供的協(xié)同刺激信號,而共刺激分子又分為具有活化作用的和具有抑制活化作用的兩類[1]。B/T淋巴細(xì)胞弱化因子(BT LA)是繼CT LA-4和PD-1之后,鑒定出的一個新的抑制性Ig超家族受體,具有一個IgV胞外功能區(qū),胞內(nèi)含有兩個酪氨酸免疫抑制基序(ITIM)結(jié)構(gòu)域,當(dāng)胞內(nèi)功能區(qū)被磷酸化時可以招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2[2]。BT LA主要表達(dá)在T和B淋巴細(xì)胞表面,在巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞和NK細(xì)胞表面也有表達(dá),通過與其配體皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)的相互作用產(chǎn)生抑制性信號,下調(diào)T、B淋巴細(xì)胞的活性[3-4]?；诖吮尘?通過BTLA胞外段來阻斷其與配體HVEM的相互作用可能為未來進(jìn)行治療性調(diào)控免疫應(yīng)答提供可行的策略。為此,我們構(gòu)建了小鼠BTLA胞外段的腺相關(guān)病毒載體,期望通過腺相關(guān)病毒作為載體的自身優(yōu)勢,為今后進(jìn)一步研究BTLA胞外段的功能及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)

腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)購自Stratagene公司,包括腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP(含報告基因hrGFP)、輔助質(zhì)粒pAAV-Helper和包裝質(zhì)粒pAAV-RC。

1.2 動物、質(zhì)粒、細(xì)胞株及抗體

C57BL/6小鼠購自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,DH5α菌株由本室保存,病毒包裝細(xì)胞AAV-293、病毒滴度檢測細(xì)胞AAV-H T1080購自Stratagene公司,卵巢上皮細(xì)胞(CHO)細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 試劑

T rizol試劑購自Invitrogen公司;DNA重組工具酶、RT-PCR用酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.4 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)已知的BTLA cDNA序列以及推測的胞外段序列進(jìn)行設(shè)計合成了基因擴(kuò)增的引物,并在5′端和3′端分別引入ClaⅠ、XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn),引物序列:上游引物 5′-CACACATCGAT TGGGAATGAAGACAGTGCC-3′,下游引物 5′-GGTGGTCTAGAAT TAGGCATTGGTGGCATCTG-3′。用T rizol試劑通過RT-PCR從C57BL/6小鼠脾臟中提取總RNA,提取操作按說明書進(jìn)行,逆轉(zhuǎn)錄的cDNA由上述引物擴(kuò)增出BTLA胞外段,PCR產(chǎn)物片段經(jīng)相應(yīng)的酶切后連接插入帶有hrGFP標(biāo)志的pAAV-IRES-hrGFP表達(dá)載體,構(gòu)建小鼠可溶性BTLA表達(dá)載體sBTLA/pAAV-IRES-hrGFP。以其轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,氨芐青霉素平板篩選,隨機(jī)挑取單個菌落進(jìn)行擴(kuò)增,抽提質(zhì)粒進(jìn)行ClaⅠ、XbaⅠ雙酶切,然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否插入,鑒定正確的克隆送測序。

1.5 含sBTLA的重組腺相關(guān)病毒的組裝

用堿裂解法大量抽提質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA(或 pAAV-IRES-hrGFP)、pAAV-Helper和pAAV-RC,測其濃度。將處于對數(shù)生長期的AAV-293細(xì)胞接種至10 cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合、狀態(tài)良好時,用鈣磷三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法將 pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA(或 pAAVIRES-hrGFP)、pAAV-Helper和pAAV-RC 3種質(zhì)粒以摩爾數(shù)1∶1∶1比例,共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞AAV-293中合成重組sBT LA-AAV和AAV空病毒,72 h后收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞,采用氯仿處理-PEG8000/NaCl沉淀-氯仿抽提法分離、濃縮、純化腺相關(guān)病毒。

1.6 重組腺相關(guān)病毒的純度鑒定

取純化后的病毒液5 μ L,加等量 2×SDS加樣緩沖液,煮沸5 min后用100 g/L SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色檢測重組sBTLA-AAV的純度。

1.7 重組sBTLA-AAV感染滴度的測定

將AAV-HT1080細(xì)胞按照3×105/孔密度接種于12孔板,每孔加1 mL培養(yǎng)液,確保細(xì)胞分布均勻,37℃孵育過夜,在進(jìn)行病毒感染前確保細(xì)胞達(dá)到80%密度。用L-DMEM(20 mL/L胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺)培養(yǎng)液1∶10倍比稀釋純化的病毒顆粒。加1 mL各稀釋度的溶液分散至12孔板中。各稀釋度做3個復(fù)孔,同時做好無病毒的陰性對照。37℃孵育2 h,孵育期間每隔30 min輕柔渦旋震蕩培養(yǎng)板。孵育后每孔加1 mL預(yù)溫的HDMEM(180 mL/L胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用熒光顯微鏡觀察重組sBTLA-AAV感染的細(xì)胞。在熒光顯微鏡下計數(shù)某孔熒光細(xì)胞的數(shù)量n(10＜n＜100),重組 sBT LAAAV感染滴度(U)=n×稀釋倍數(shù)。

1.8 重組 sBTLA-AAV感染CHO細(xì)胞及sBTLA的表達(dá)鑒定

接種CHO細(xì)胞于10 mL培養(yǎng)瓶中,過夜培養(yǎng)至次日達(dá)80%密度。將細(xì)胞更換含50 mmol/L正丁酸鈉(Sigma公司)的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。加入10-6稀釋的純化重組sBT LA-AAV病毒,另以AAV空病毒作對照,病毒孵育6 h后,更換不含血清的DMEM 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后,收集培養(yǎng)上清液并濃縮至1/10體積。加等體積2×SDS上樣緩沖液,沸水浴5 min后,上樣30 μ L 行150 g/L SDS-PAGE電泳。將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,室溫封閉2 h后按化學(xué)發(fā)光試劑盒說明進(jìn)行免疫雜交,化學(xué)發(fā)光底物顯色,將結(jié)果曝光于X線片上。

2 結(jié)果

2.1 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA的構(gòu)建

將pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA表達(dá)載體擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,用ClaⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切分析,切出長約500 bp和6 kb的兩片段,分別為BT LA胞外段和pAAV-IRES-hrGFP的載體片段,而空載體未切出BT LA胞外段的片段(圖 1)。對重組質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA中插入片段測序,結(jié)果顯示其序列與已經(jīng)報道的編碼序列完全一致。

圖1 重組pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA限制性內(nèi)切酶鑒定Fig.1 Identification of Recombinant pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA by restriction endonuclease

2.2 SDS-PAGE鑒定重組腺相關(guān)病毒的純度

重組腺相關(guān)病毒衣殼蛋白由3種蛋白組成,分別為VP1、VP2和VP3。3種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分別為87、72和62 kD,比例為1∶1∶10,純化后的重組腺相關(guān)病毒液經(jīng)SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色后可見到3條特異的條帶,其濃度比約為1∶1∶10(圖2),其余雜帶不明顯,表明所純化的重組AAV病毒純度較高,可以用于動物實(shí)驗(yàn)。

圖2 純化后重組sBTLA-AAV SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE of purified recombinant sBTLA-AAV

2.3 重組sBTLA-AAV感染滴度的測定

將純化的重組sBTLA-AAV病毒顆粒倍比稀釋感染AAV-HT1080細(xì)胞,在熒光顯微鏡下計數(shù)熒光細(xì)胞(圖3),經(jīng)計算純化后重組病毒的感染滴度為1.8×1010U/mL。

圖3 重組sBTLA-AAV感染細(xì)胞AAV-HT1080檢測病毒滴度Fig.3 T he virus titers of AAV-HT1080 from recombinant sBTLA-AAV-infected cells

2.4 重組 sBTLA-AAV感染CHO細(xì)胞及sBTLA的表達(dá)鑒定

分別將重組sBTLA-AAV病毒和AAV空病毒感染CHO細(xì)胞,感染后72 h的培養(yǎng)上清液濃縮液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至 PVDF膜上,ECL Western blot法結(jié)果顯示(圖4),在與前者雜交后形成一條非常特異的條帶,而后者無特異條帶形成,顯示重組sBT LA-AAV病毒能在體外感染CHO細(xì)胞并正常表達(dá)sBTLA基因。

圖4 重組sBTLA-AAV感染CHO細(xì)胞的Western blot結(jié)果Fig.4 Western blot of recombinant sBT LA-AAV-infected CHO cells

3 討論

T細(xì)胞可以從抗原提呈細(xì)胞獲得第一和第二信號,而第二信號又分為刺激性信號和抑制性信號。B/T淋巴細(xì)胞弱化因子(BT LA)是CD28超家族分子中一個新發(fā)現(xiàn)的抑制性受體。BTLA組成性表達(dá)在CD4+和CD8+的T細(xì)胞表面并且在T細(xì)胞活化后表達(dá)上調(diào)。除此以外,BTLA還表達(dá)在B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓來源的DC細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。近年來,腫瘤壞死因子受體超家族中的成員之一單純皰疹進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)被確認(rèn)為是與BT LA相互作用的配體[5]。HVEM不僅表達(dá)在靜止 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和未成熟DC細(xì)胞表面,還能表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上[6]。用抗原受體使BT LA發(fā)生交聯(lián)可以導(dǎo)致抗CD3單抗引起的IL-2分泌減少[7]。BT LA完全缺失的基因敲除小鼠表現(xiàn)出對TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的高反應(yīng)性,也同樣體現(xiàn)了BT LA作為抑制性分子的重要作用[2]。因此,封閉此途徑有可能成為腫瘤免疫治療的調(diào)控靶點(diǎn)。

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)是復(fù)制缺陷的細(xì)小病毒,它是目前基因治療及其他基因轉(zhuǎn)移操作中倍受青睞的工具,其用于基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)具有以下特點(diǎn):感染的細(xì)胞范圍廣,可感染分裂和不分裂的細(xì)胞;病毒滴度高;表達(dá)的蛋白可正確折疊及修飾;免疫原性小,引起的副反應(yīng)相對較少;相對較高生物安全等級,定點(diǎn)整合能保證目的基因的長期穩(wěn)定表達(dá)[8]。由于腫瘤免疫治療是一個時間較長的復(fù)雜過程,因此將AAV作為sBT LA的載體感染宿主腫瘤局部細(xì)胞,可望實(shí)現(xiàn)sBT LA蛋白在宿主腫瘤局部長期穩(wěn)定表達(dá),從而有望對宿主產(chǎn)生持續(xù)的抗腫瘤作用。

本研究中,我們將從小鼠脾臟擴(kuò)增出來的BTLA胞外段的基因片段插入AAV骨架質(zhì)粒載體pAAV-IRES-hrGFP中,進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒的組裝、純化,得到了純度較高的重組腺相關(guān)病毒顆粒,并進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證明了重組病毒顆粒能在體外感染真核細(xì)胞CHO并正確表達(dá)BTLA胞外段分子。我們期望通過sBTLA-AAV表達(dá)的可溶性BT LA胞外段能夠結(jié)合HVEM,封閉HVEM上的BT LA結(jié)合位點(diǎn),阻斷T細(xì)胞表面的BTLA與HVEM的相互作用,阻斷抑制信號,從而減弱或解除其對腫瘤特異T細(xì)胞的抑制作用,促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化,產(chǎn)生更強(qiáng)的腫瘤免疫效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)為將可溶性BT LA應(yīng)用于腫瘤免疫,研究其抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。

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