馬衣努爾·買提托合提 韓凌斐 廖術杰 周志剛 董 紅 馬 丁 王世宣

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030

皰疹病毒侵入介體(herpes virus entry mediator,HVEM)是1996年被Montgomery等[1]發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤壞死因子受體超家族成員,主要表達在T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞和中性粒細胞表面[2],同時HVEM也廣泛表達在各內(nèi)臟器官。目前發(fā)現(xiàn) HVEM 有 5個配體,分別是 HSV.gD、LIGHT 、LT-α,BT LA 和 CD160[3-4]。HVEM 與不同的配體結合發(fā)揮不同的生物學作用,與單純皰疹病毒包膜糖蛋白D(HSV.gD)結合介導HSV感染細胞過程[5];HVEM與其配體信號通路 LIGHT/LTα/HVEM 在T細胞活化提供共刺激信號、腫瘤免疫、移植免疫、炎癥反應、自身免疫性疾病的發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的作用[6]。HVEM分子中的一個位點可以和免疫球蛋白超家族成員B,T淋巴細胞弱化因子(BT LA)結合,而BT LA是一種抑制性的信號蛋白可以抑制T細胞活化[7]。另外,新近發(fā)現(xiàn)它可與另一配體 CD160結合而抑制 T細胞增殖[8],可能為自身免疫病的治療提供新思路。因此在本研究中我們進行了重組rAAV-HVEM病毒顆粒的包裝、純化、滴度測定及感染真核細胞后HVEM的表達鑒定,為探討其在各種疾病免疫調(diào)控系統(tǒng)中扮演的角色及其機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及腺相關病毒載體系統(tǒng)

E.coli DH-5α菌株為本室保存,質(zhì)粒 pcDNA3.1購自TaKaRa Biotec公司,腺相關病毒載體系統(tǒng)購自Stratagene公司,包括腺相關病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP(含報告基因hrGFP)輔助質(zhì)粒pAAV-Helper和包裝質(zhì)粒pAAV-RC。

1.2 實驗動物和細胞株

C57B/6小鼠購自湖北省醫(yī)學實驗動物中心。病毒包裝細胞AAV-293購自Stratagene公司,中國倉鼠卵巢細胞(CHO)細胞株購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 主要試劑

T rizol試劑購自Invitrogen公司。DNA重組工具酶,RT-PCR用酶為 TaKaRa公司產(chǎn)品。HVEM單克隆抗體購自Santa Cruz公司。SYBR GreenⅠ為Biowhittaker Molecular Application公司產(chǎn)品。正丁酸鈉購自Sigma公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

AAV-293細胞用DMEM培養(yǎng)液、CHO細胞用1640培養(yǎng)液加100 mL/L胎牛血清,110 mL/L丙酮酸鈉,2 mmol/L-谷氨酰胺,于 37℃、5%CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 重組腺相關病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/HVEM的構建及鑒定

根據(jù)已知的HVEM cDNA序列,設計合成了基因擴增的引物,并在5′端和3′端分引入 EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ限制性酶切位點。上游引物為5′-ACACCGAAT TCATGGAACCTCTCCCAGGAT-3′, 下游引 物 為 5′-TATGTGGATCCTCTGT TGGAGGCTGTCTC-3′。以質(zhì)粒pcDNA3.1-HVEM 為模板進行PCR擴增后,通過酶切,連接插入帶有hrGFP標志的pAAV-IRES-hrGFP表達載體,構建小鼠HVEM表達載體pAAV-IRES-HVEM-hrGFP。以其轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,氨芐平板篩選。隨機挑取單個菌落進行擴增,抽提質(zhì)粒進行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切,然后在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳鑒定目的片段是否插入。鑒定正確的克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6 含HVEM的腺相關病毒的組裝

用堿裂解法大量抽提質(zhì)粒pAAV-IRESHVEM-hrGFP 、pAAV-IRES-hrGFP 、pAAV-Helper和pAAV-RC,測其濃度。將處于對數(shù)生長期的AAV-293細胞接種至10 cm培養(yǎng)皿中,待細胞達90%融合、狀態(tài)良好時采用磷酸鈣法將pAAVIRES-HVEM-hrGFP重組表達質(zhì)粒連同輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)(pAAV-RC和pAAV-Helper)共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞,繼續(xù)培養(yǎng)60～72 h后出現(xiàn)明顯細胞病變效應(CPE)時即90%～100%的細胞腫脹、變圓,10%～20%的細胞脫壁漂浮,72 h后收集培養(yǎng)上清液和細胞[9]。采用氯仿處理-PEG 8000/NaCl沉淀-氯仿抽提法分離、濃縮、純化腺相關病毒[10]。

1.7 重組腺相關病毒的純度鑒定

取10 μ L純化的病毒液,加等量2×SDS加樣緩沖液,煮沸 5 min,冷卻至室溫,取 10 μ L加樣。利用SDS-PAGE電泳鑒定rAAV-HVEM的外殼蛋白,分離膠120 g/L,濃縮膠50 g/L,將凝膠板安置于電泳槽,然后進行點樣,按8 V/cm的電壓進行電泳,當染料前沿進入分離膠后,電壓提高到15 V/cm,直至溴酚藍遷移至凝膠下端,結束電泳。取出凝膠置于染色盤,考馬斯亮藍振蕩染色3 h,脫色液脫色,掃描鑒定。

1.8 重組HVEM-AAV滴度的測定

實時定量PCR法測定rAAV-HVEM的滴度:取 40 μ L 病毒液 ,加入 10 ×DNase緩沖液 20 μ L,無血清 DMEM 133 μ L,40 U DNase Ⅰ-RNasefree 3 μ L,RNAse 4 μ L,37℃孵育2～ 3 h;上述反應液200 μ L加2×蛋白酶 K buffer,蛋白酶 K 10 μ L,37℃孵育1 h;酚∶氯仿∶異戊醇抽提1次,氯仿∶異戊醇抽提1次。再將上述樣品沸水浴5 min,立即置于冰上2 min;用PCR緩沖液將標本作不同濃度稀釋。熒光定量PCR反應體系如下,模板DNA 1 μ L,10 μ mol/L real-time 引物 1 μ L,master mix 12.5 μ L,H2O 10.5 μ L;PCR 反應條件為:94℃預變性 2.5 min,然后94℃變性 15 s,52℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共進行40個循環(huán)[11]。

1.9 重組HVEM-AA V感染CH O細胞及HVEM的表達鑒定

接種CHO細胞于10 mL培養(yǎng)瓶中,過夜培養(yǎng)至次日達80%密度。將細胞更換含50 mmol/L正丁酸鈉(Sigma公司)的完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。加入不同滴度稀釋的純化rAAV-HVEM病毒,另以AAV空病毒作對照。病毒孵育6 h后,更換不含血清的不完全1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)觀察熒光,72 h后收集細胞,一部分細胞提取RNA進行RT-PCR檢測,另一部分細胞用 PBS洗一遍,加HVEM單克隆抗體37℃孵育1 h,PBS洗2遍后進行流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 重組腺相關病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-hrGFP/HVEM的構建

以質(zhì)粒pcDNA3.1 HVEM為模板進行PCR擴增后,連接插入pAAV-IRES-hrGFP表達載體,以其轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,氨芐平板篩選。隨機挑取單個菌落,擴增后提取質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ進行酶切分析,篩選出含目的片段的陽性克隆菌株(圖1、2)。DNA測序結果顯示所克隆的DNA序列與已經(jīng)報道的HVEM編碼序列完全一致。

2.2 重組腺相關病毒rAAV-HVEM的組裝

采用磷酸鈣法將pAAV-IRES-HVEM-hrGFP重組表達質(zhì)粒連同輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)(pAAVRC和pAAV-Helper)共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞,轉(zhuǎn)染48 h后看熒光觀察轉(zhuǎn)染效果(圖3),轉(zhuǎn)染效率達70%～80%。繼續(xù)培養(yǎng)60～72 h后出現(xiàn)明顯細胞病變效應(CPE)時收集病毒。

圖3 pAAV-IRES-HVEM-hrGFP、pAAV-RC和 pAAVHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞后熒光表達(×100)Fig.3 The GFP expression of AAV-293 cells co-transfected by pAAV-IRES-HVEM-hrGFP,pAAV-RC and pAAV-Helper(×100)

2.3 SDS-PAGE鑒定重組腺相關病毒的純度

重組腺相關病毒外殼由3種蛋白組成,分別為VP1、VP2和VP3。3種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分別為87、72和62 kD,比例為1∶1∶10。純化后的重組HVEM腺相關病毒經(jīng)SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色后可見到3條特異的條帶,其濃度比約為1∶1∶10(圖4)。其余雜帶不多,表明所純化的重組HVEM腺相關病毒純度較高,可以用于動物實驗。

圖4 純化后的重組HVEM腺相關病毒SDS-PAGE電泳結果Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis analy ses oftherAAVHVEM virus after purification

2.4 rAAV-HVEM滴度的測定

應用實時定量PCR技術,檢測 rAAV-HVEM基因組拷貝數(shù),結果顯示經(jīng)過純化濃縮的 rAAVHVEM的滴度可以達到5×1010v·g/mL。

2.5 rAAV-HVEM感染CH O細胞及HVEM的表達鑒定

分別將 5×103、5×104、5×105MOI rAAVHVEM病毒和AAV空病毒感染CHO細胞,感染后48 h觀察熒光表達率(圖5)發(fā)現(xiàn)隨著病毒滴度的增加轉(zhuǎn)染效率也增加。72 h后收集一半細胞提取RNA做 RT-PCR檢測,電泳結果(圖 6)顯示HVEM表達條帶顏色隨著病毒滴度的增加而加深。另一半細胞通過流式細胞儀分析HVEM表達量(圖7)。顯示 rAAV-HVEM 病毒能在體外感染CHO細胞并正常表達HVEM基因。

圖5 不同滴度rAAV-HVEM病毒感染CHO細胞的熒光表達(×200)Fig.5 The GFP expression of CHO cells transfected by rAAV-HVEM in different MOI(×200)

圖6 RT-PCR鑒定 HVEM RNA在不同滴度 rAAVHVEM感染的CHO細胞中的表達Fig.6 Expression of HVEM mRNA in CHO cells transfected with rAAV-HVEM

3 討論

圖7 不同滴度rAAV-HVEM感染的CHO細胞HVEM表達量流式分析結果Fig.7 Flow cytomytry of HVEM expression in CHO cells transfected by rAAV-HVEM

初始T淋巴細胞活化是通過T細胞受體(T cell receptor,TCR)和抗原遞呈細胞上的抗原肽-MHC分子復合物的相互作用而引起的[12]?？乖R別和多種刺激信號一起決定了 T細胞應答的質(zhì)量[13]。如果缺乏共刺激信號,T細胞的活化就不是持久的。協(xié)同刺激信號在T細胞活化和保護性免疫應答中是必須的,同時免疫抑制信號也在保持T細胞自身耐受和保護自身免疫中扮演著非常重要的角色,因此刺激性和抑制性信號平衡決定著免疫應答結果。共刺激信號系統(tǒng)作為新出現(xiàn)的重要靶點可以弱化自身免疫性疾病或者增強抗腫瘤免疫應答。初始的協(xié)同刺激受體屬于IG(CD28等)或 TNF受體(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族[14]。腫瘤壞死因子受體超家族(Tumor necrosis factorreceptor superfamily,TNFRSF)成員具有誘導細胞凋亡,介導炎癥反應和自身免疫病的發(fā)生等作用。

HVEM是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族成員,主要表達于T細胞、B細胞和單核細胞,HVEM與其配體結合發(fā)揮多種免疫調(diào)節(jié)作用,與一個配體結合后可改變HVEM空間構象,而影響HVEM與其它配體的結合。HVEM與LIGH T結合作為共刺激信號激活T細胞應答,參與T細胞的增殖與保護性免疫應答;而與BT LA結合則作為共抑制信號抑制T細胞應答,對維持T細胞的耐受及防治自身免疫病具有重要的意義。LIGH THVEM-BTLA通路的發(fā)現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)提供了3個靶點,并有望用于自身免疫性疾病、癌癥和感染性疾病的治療[15]。腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)是復制缺陷的細小病毒[16],其用于基因轉(zhuǎn)染、表達具有以下特點:感染的細胞范圍廣,可感染分裂和不分裂的細胞;低免疫原性,低毒性;表達的人蛋白可正確折疊及修飾;定點整合至19號染色體的一個2～4 kb的區(qū)域(19q13.32qter),既可避免隨機整合可能出現(xiàn)的插入性突變,又可長期穩(wěn)定表達攜帶的外源基因[17],但有擴增需要輔助病毒及滴度低等局限性。本實驗中我們將從質(zhì)粒pcDNA3.1 HVEM中擴增出來的小鼠 HVEM的基因片段插入質(zhì)粒載體pAAV-IRES-hrGFP,進行重組腺相關病毒的組裝、純化,得到了純度較高的重組腺相關病毒,進一步的實驗證明重組病毒顆粒能在體外感染真核細胞并正確表達HVEM分子。

HVEM在炎癥反應和抑制信號之間扮演著一個分子開關的角色[15]。用指向于細胞表面受體的激動劑能夠恢復內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和重新調(diào)整免疫和炎癥反應的過程,這將有利于治療自身免疫性疾病,感染性疾病和癌癥?？扇苄訦VEM存在于許多疾病患者的血清中,推測其可能在一些疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用,因此在某些疾病的病因分析及治療中存在著潛在的應用價值。

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