王桂華 孫 黎 鄧 豫 李小蘭 曹小年來森艷 陶德定 胡俊波△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1分子醫(yī)學(xué)中心 2腫瘤科,武漢 430030

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)是生長(zhǎng)因子調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子,在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、抑制凋亡、糖代謝等方面發(fā)揮著非常重要的作用[1]。它由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成,不同的調(diào)節(jié)亞基和催化亞基結(jié)合介導(dǎo)著不同的PI3K通路[1-3]。p55PIK是PI3K的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基,能夠同PI3K的110 kD催化亞基形成穩(wěn)定的復(fù)合物,有研究表明p55PIK同腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。p55PIK區(qū)別于PI3K其他調(diào)節(jié)亞基最大的不同在于其末端存在獨(dú)特的24個(gè)氨基酸殘基(N24),在我們的前期研究中證實(shí)利用質(zhì)粒或腺病毒載體在細(xì)胞內(nèi)外源性表達(dá)N24能夠有效地抑制多種人類腫瘤細(xì)胞增殖[6-11],但是利用外源性手段表達(dá)N24在腫瘤治療中的應(yīng)用受到了廣泛的限制,尋找新的N24應(yīng)用手段成為將N24開發(fā)成有效抗腫瘤藥物亟待解決的問題。本研究通過體外表達(dá)并純化具有跨膜功能的TAT-N24,并證實(shí)了TATN24的有效生物學(xué)活性。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

DH5α和BL21大腸埃希菌為本研究室保存菌種,IPTG購(gòu)自Sigma公司,K pnⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自NEB公司,攜帶N24片段的N24-GFP質(zhì)粒和pTAT-HA空質(zhì)粒由美國(guó)夏獻(xiàn)民教授惠贈(zèng),anti-HA鼠單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司,羊抗鼠FITC熒光抗體購(gòu)自DAKO公司,結(jié)腸癌HT29細(xì)胞由本研究室傳代培養(yǎng),DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司,質(zhì)粒測(cè)序委托Invitrogen公司完成,流式細(xì)胞儀FACSort為美國(guó)Becton Dickson公司產(chǎn)品。

1.2 pTAT-HA-N24質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序鑒定

取N24-GFP質(zhì)粒和pTAT-HA空質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸埃希菌,挑取單克隆搖菌,菌液送Invitrogen公司測(cè)序確定正確后堿裂解法大提質(zhì)粒。將大提質(zhì)粒分別取4 μ L以KpnⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶37℃雙酶切1 h,酶切產(chǎn)物凝膠電泳后回收DNA片段,將回收的線性pTAT-HA質(zhì)粒同N24片段以T4連接酶16℃連接過夜,連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸埃希菌,挑取單克隆,搖菌送Invitrogen公司測(cè)序。

1.3 TAT-N24融合多肽的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的pTAT-HA-N24質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21大腸埃希菌中,挑取單克隆搖菌,獲得表達(dá)菌株并測(cè)序鑒定菌株正確。取含有pTAT-HAN24質(zhì)粒的BL21菌種100 μ L置10 mL含1∶500氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37℃搖菌過夜,取1 mL菌液置1 L含1∶500氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37℃搖菌,待細(xì)菌濃度吸光度(A)值達(dá)到0.5～0.7時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后收集細(xì)菌。采用鎳螯合柱(Qiagen)純化TAT-N24蛋白,純化方法依據(jù)鎳柱使用說明。

1.4 TAT-N24穿膜能力和基本物理性質(zhì)測(cè)定

將純化后的 TAT-N24加入細(xì)胞爬片培養(yǎng)的HT29細(xì)胞中,置37℃含5%CO2溫箱中培養(yǎng)12 h后,免疫細(xì)胞化學(xué)染色,熒光顯微鏡下觀察TAT-N24是否入胞及入胞效率。SDS凝膠電泳確定TAT-N24的分子量,采用不同溶劑溶解TAT-N24,蛋白質(zhì)濃度測(cè)定TAT-N24在不同溶劑中的溶解度。

1.5 TAT-N24生物學(xué)活性檢測(cè)

將純化后的 TAT-N24作用培養(yǎng)的結(jié)腸癌H T29細(xì)胞,以AD-N24-GFP為對(duì)照,比較 TATN24和 AD-N24-GFP對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響。以TAT-N24融合多肽處理結(jié)腸癌HT29細(xì)胞24 h后收取細(xì)胞,用PBS洗1遍,80%冷乙醇或100%甲醇固定后-20℃過夜。取部分固定后細(xì)胞用PBS洗1遍 ,室溫 、避光下 PI染色(PI 50 μ g/mL,RNase 100 μ g/mL,0.1%triton)至少 30 min后上樣,流式細(xì)胞儀檢測(cè),Modfit 3軟件分析細(xì)胞周期結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pTAT-HA-N24質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序鑒定

pTAT-HA-N24質(zhì)粒構(gòu)建后Invitrogen公司測(cè)序結(jié)果顯示序列正確,已經(jīng)成功將N24片段克隆進(jìn)入pTAT-HA質(zhì)粒。

2.2 TAT-N24結(jié)構(gòu)模式圖

TAT-N24融合多肽表達(dá)純化后由4部分功能域組成,4部分分別實(shí)現(xiàn)了TAT-N24的生物活性、穿膜、純化和標(biāo)記等功能。如圖1所示,其中N24部分為活性部位,抑制細(xì)胞異常增殖;穿膜肽(TAT)具有穿過細(xì)胞膜能力;6×寡聚組氨酸用于重組多肽的純化;HA-tag用于多肽檢測(cè)。

圖1 TA T-N24多肽結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 T he schematic diagram of TAT-N24 polypeptide

2.3 TAT-N24融合多肽的表達(dá)和純化

經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),TAT-N24經(jīng)過Ni+螯合樹脂純化后可以獲得純度較高的 TAT-N24融合多肽,圖2示純化后的 TAT-N24分子量約 10 kD,SDS凝膠電泳未見明顯雜蛋白。

2.4 TAT-N24穿膜能力和基本理化性質(zhì)測(cè)定

圖2 SDS凝膠分析純化后的T AT-N24融合多肽Fig.2 T he analy sis of TAT-N24 polypeptide by SDS-page af-

將純化而得的TAT-N24分別溶解于6 mol/L尿素,DMSO,PBS中,測(cè) TAT-N24在 3種不同類型溶劑中的溶解度分別為(25.00±1.05)、(20.00±0.56)、(1.00±0.04)mg/mL。將純化后的TAT-N24短肽加入培養(yǎng)的HT29細(xì)胞,12 h后可見＞90%細(xì)胞均有TAT-N24短肽的進(jìn)入,TATN24穿膜能力較強(qiáng)(圖3)。

圖3 T AT-N24穿膜能力檢測(cè)Fig.3 The detection of TAT-N24-penetrating ability

2.5 TAT-N24的生物學(xué)活性檢測(cè)

TAT-N24融合多肽處理HT29細(xì)胞24 h后,流式細(xì)胞儀分析TAT-N24對(duì)H T29細(xì)胞周期的影響,以Ad-N24-GFP為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果提示相對(duì)空白對(duì)照組而言,Ad-N24-GFP和TAT-N24均能有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌 HT29細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯(P＜0.05),TAT-N24誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯能力較腺病毒表達(dá)N24顯著增強(qiáng)(P＜0.05)(圖4)。

3 討論

PI3K是生長(zhǎng)因子調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中連接細(xì)胞外信號(hào)的一個(gè)重要分子,PI3K的調(diào)節(jié)亞基沒有酶活性,但它能促使催化亞基定位到細(xì)胞內(nèi)特異位置并調(diào)控其催化活性,PI3K功能的特異性發(fā)揮是由其調(diào)節(jié)亞基決定的[1-4]。p55PIK是Pons等[4]發(fā)現(xiàn)的PI3K的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基,p55PIK區(qū)別于PI3K其他調(diào)節(jié)亞基(p85PIK、p50PIK)的最大不同就是其氨基端存在的24個(gè)氨基酸,美國(guó)John Hopkins大學(xué)Xia等研究發(fā)現(xiàn)p55PIK可通過其氨基端這24個(gè)氨基酸(N24)同Rb蛋白特異性結(jié)合,參與Rb蛋白對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。在我們的前期研究中利用腺病毒在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)N24能夠有效地抑制結(jié)腸癌H T29細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,在體內(nèi)有效地抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),提示N24具備開發(fā)成為有效抗腫瘤藥物的潛能[12]。但是利用腺病毒高表達(dá)N24治療腫瘤存在生物安全性和腺病毒本身毒性的影響,使Ad-N24-GFP很難走向臨床。

圖4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期Fig.4 Flow cytometry analysis of cell cycle

近年來,人們發(fā)現(xiàn)了一系列自然存在或人工合成的能幫助生物大分子穿透細(xì)胞膜的分子(protein/peptide transduction domain,PTD),PTD能將與其連接的多肽或其他生物大分子導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高而且對(duì)細(xì)胞沒有損傷,可以解決多肽/蛋白質(zhì)進(jìn)行分子治療的入胞難題[13]。其中,來自 HIV病毒的 Tat蛋白質(zhì)中的 PTD(TAT)被廣泛應(yīng)用在幫助其他生物大分子穿透細(xì)胞膜的研究中,但是,很少有成功將該片段應(yīng)用于體內(nèi)投送具有治療作用的生物大分子的報(bào)告。本研究利用分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)技術(shù)構(gòu)建并表達(dá)了N24融合蛋白 TAT-N24,純化后得到的融合蛋白具有較高的純度和有效穿膜能力,同時(shí)純化后的TATN24融合蛋白保留了N24的生物學(xué)活性,能夠有效地誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。通過本研究有效地解決了將N24送入胞內(nèi)的難題,為N24開發(fā)成為有效的腫瘤生物治療藥物奠定了基礎(chǔ),但本研究未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)TAT-N24的抗腫瘤作用,這將是下一步研究的重點(diǎn)。

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