李劍峰，張淑卿，師尚禮，霍平慧

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070)

磷是植物生長發(fā)育不可或缺的重要元素，我國大部分區(qū)域土壤平均含磷量0.12%，但其在土壤溶液中的濃度一般僅有0.005～1.0 mg/kg，總量充足而可溶性磷含量匱乏，難以供植物直接吸收利用[1]，而施入土壤的化學(xué)磷肥利用率很低，通常只有5%～25%[2]。而解磷微生物產(chǎn)生的植酸酶，核酸酶和磷酸酶等加速了植酸、核酸、磷脂等含磷有機(jī)化合物的分解，這些有機(jī)酸可與無機(jī)磷進(jìn)行螯合[3]，使土壤中的難溶性無機(jī)磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化[4]，是改善植物磷素營養(yǎng)，增加土壤中的可溶性磷[5，6]的重要途徑。目前，對微生物參與難溶態(tài)磷素利用的研究多局限在芽孢桿菌(Bacillus megaterium)[7]和真菌、放線菌等方面，而對涉及解磷根瘤菌菌種培養(yǎng)和發(fā)酵的研究報道較少。祁娟等[8]在苜蓿種子中分離得到一株根瘤菌SL01，具備溶解難溶性無機(jī)磷的能力，有較好的利用價值和開發(fā)潛力，但解磷根瘤菌同其他微生物一樣對特定的培養(yǎng)環(huán)境有特定的要求，不同的培養(yǎng)基類型和濃度下，菌種的發(fā)酵速度有很大的差異[9]，并且在根瘤菌制劑的不同工藝流程中，對菌株生長速度，發(fā)酵培養(yǎng)液的營養(yǎng)容量都有不同的要求。因此，研究擬通過對SL01菌株在不同類型和濃度培養(yǎng)基下的發(fā)酵速度和培養(yǎng)基的pH值變化進(jìn)行比較和分析，以期得到適于SL01菌株液體發(fā)酵的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基。為解磷根瘤菌培養(yǎng)條件的研究及解磷根瘤菌制劑的生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株為解磷苜蓿根瘤菌SL01，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點試驗室提供。

YMA培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[10]的方法配制，KH2PO4 0.5 g ，酵母粉 1.0 g，甘露醇 10.0 g ，MgSO4.7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，pH 值6.8～ 7.2，蒸餾水 1 000 mL 。YMA剛果紅固體培養(yǎng)基[11]每升加10 mL 0.25%的剛果紅溶液和15.0克瓊脂。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[12]:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g ，水 1 000 mL ，pH 7.2。

LB培養(yǎng)基參考[12]:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl10.0 g，蒸餾水 1 000 mL ，pH 值 7.0～7.2

按以上3種培養(yǎng)基配方分別配制含其完全培養(yǎng)基百分?jǐn)?shù)為100%，50%和25%，共計6個類型的液體培養(yǎng)基。

儀器和設(shè)備采用英國Jenway公司生產(chǎn)的3305型pH計；WPA S2000型紫外/可見光分光光度計，T HC-C自動控溫調(diào)速振蕩生化培養(yǎng)箱

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基類型及濃度的篩選 將4℃下YMA斜面保存的SL01菌種連同試管斜面在28℃下活化24 h，將活化菌種接一環(huán)到裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃，120 r/min避光培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每2 h以分光光度計測定菌液OD600nm吸光度值，連續(xù)測定30 h。同時以pH計測定菌液pH值，每處理3次重復(fù)。

菌體含量的測定:參照唐勇等[13]及梁錦峰等[15]的方法在OD600nm測定菌液的吸光度值，以濁度法用600 nm的OD值表示發(fā)酵液的菌體含量。

1.2.2 透氣條件的比較 在選擇出適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基后，在裝有50 mL YMA液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中接入菌株，以膠塞密封瓶口作為密閉培養(yǎng)處理，并以透氣封口膜封裝瓶口的處理作為透氣培養(yǎng)。所有處理在28℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)，每處理4次重復(fù)。培養(yǎng)24 h后分別取各處理稀釋1×104、1×106和1×108倍的菌液0.2 mL，均勻涂抹在9 cm直徑的YMA剛果紅固體平板上，28℃培養(yǎng)24 h，以稀釋平板法測算每毫升菌液中的活菌含量，并選取單菌落數(shù)在30～300的固體平板，測定單菌落的直徑。每處理6次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用DPS 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌培養(yǎng)基類型和濃度的選擇

測定了SL01菌株在供試的3個類型共9種液體培養(yǎng)基中生長的OD值，并繪制曲線(圖1)。菌株在LB和1/2 LB液體培養(yǎng)基中最先進(jìn)入快速生長期，并將快速生長期分別維持到第28 h和26 h，說明菌株在這兩種培養(yǎng)基中生長的速率顯著高于在YMA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長速率(P＜0.05)，且30 h內(nèi)的菌液OD值均顯著高于其他液體培養(yǎng)基。但1/4濃度的LB培養(yǎng)基在14 h后營養(yǎng)基本消耗殆盡，菌液OD值不再變化。YMA完全培養(yǎng)基中，發(fā)酵菌液的OD值增高速率較LB培養(yǎng)基稍低，但對數(shù)期生長期較LB培養(yǎng)基更長，穩(wěn)定期出現(xiàn)的較遲。1/2 YMA和1/4 YMA培養(yǎng)基中，菌液的OD值分別在22 h和26 h時趨于停滯，而YMA完全培養(yǎng)基發(fā)酵液的OD值則在30 h內(nèi)始終增長。SL01菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長最差，并很快達(dá)到穩(wěn)定期和衰老期。

圖1 不同液體培養(yǎng)基中的SL01菌株發(fā)酵液的菌體含量Fig.1 Rhizobia densities of SL01 strain in different liquid culture mediums

2.2 不同類型培養(yǎng)基SL01發(fā)酵菌液的pH值變化

通過測量發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基酸度發(fā)現(xiàn)，所有培養(yǎng)液在最初6 h，pH值均隨菌密度的增大而降低，表明SL01菌株在開始快速繁殖時產(chǎn)生了大量酸性物質(zhì)，在6～12 h，YMA培養(yǎng)基發(fā)酵液持續(xù)變酸，LB培養(yǎng)基，1/2和1/4牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基發(fā)酵液的pH值卻不斷升高(圖2)。菌株在對數(shù)期代謝旺盛，能夠利用碳源和氮源產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，在碳氮源均充足的條件下，隨著菌體密度的增大，發(fā)酵液的pH值持續(xù)降低。當(dāng)碳源不足時，部分菌體發(fā)生自溶現(xiàn)象，釋放出胞內(nèi)氨態(tài)氮等堿性物質(zhì)，使得pH值上升[13]。故此，發(fā)酵液pH值的升高說明菌液中發(fā)生自溶的菌體數(shù)目增多，菌株的產(chǎn)酸代謝變緩。解磷根瘤菌分泌的大量有機(jī)酸使SL01菌株具備了溶解難溶性無機(jī)磷的特性。供試液體培養(yǎng)基中，YMA、1/2 YMA、1/4 YMA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的碳源較為充足，使其發(fā)酵液的pH值始終降低。1/2、1/4的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基則明顯碳源不足，在發(fā)酵6 h后，菌液的OD值雖持續(xù)上升，但pH值明顯上升?？梢?，發(fā)酵液中pH值的增高不利于菌株的生長和解磷。

充足的碳源不僅是解磷根瘤菌生長繁殖的必要條件，也促進(jìn)了菌株的解磷能力。將SL01菌株接種于含過量難溶性無機(jī)磷(磷酸鈣)和不同碳源含量的無磷液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后，通過測定發(fā)酵菌液中的可溶性磷含量可以發(fā)現(xiàn)，充足的碳源能使SL01菌株的解無機(jī)磷能力發(fā)揮到最高水平，而在碳源不充足時，SL01菌株的解磷能力明顯減弱。

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵菌液的pH值變化Fig.2 pH value change of fermentation broth in different culture mediums

表1 培養(yǎng)透氣對發(fā)酵菌液活菌含量和菌株單菌落直徑的影響Table 1 Effects of ventilation condition on live rhizobia content and clone diameter of strains in fermentation

2.3 透氣條件對發(fā)酵液內(nèi)有效菌含量及菌種單菌落直徑的影響

通過比較不同透氣培養(yǎng)條件下SL01菌株發(fā)酵液的活菌量和菌株生長活性發(fā)現(xiàn)，透氣培養(yǎng)24 h菌液中根瘤菌的活菌數(shù)目為密閉培養(yǎng)下的10.51倍，差異顯著(P＜0.05)。透氣條件下培養(yǎng)得到的菌種在YMA固體平板上的單菌落直徑也顯著大于密閉培養(yǎng)得到的菌種，說明發(fā)酵中的透氣條件對于SL01菌株的繁殖速度和菌株單菌落生長速度有較大影響。

3 結(jié)論與討論

(1)LB和1/2 LB培養(yǎng)基適宜用于溶磷根瘤菌SL01的快速發(fā)酵，在有限體積的菌液中能存活高密度的菌體，因此，適合于進(jìn)行SL01菌株的快速發(fā)酵繁殖，用于種子培養(yǎng)基能有效的提高生產(chǎn)效率。但同時也由于菌株繁殖過快，LB培養(yǎng)基中的營養(yǎng)會在短時間內(nèi)耗盡，使得菌體大量死亡，故不宜用于長期保存大量的菌種。YMA液體培養(yǎng)基由于能使發(fā)酵過程保持較長的快速生長期，菌株處于高增殖活力階段的時間較長，故可用于保存大量的活菌，這一結(jié)論與尚軍紅等[14]的研究結(jié)果一致。

SL01菌株在3種類型不同濃度的液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長速率差異較大，但快速生長期階段菌體的密度均與培養(yǎng)基的濃度間呈正相關(guān)，說明液體發(fā)酵培養(yǎng)中，菌株的繁殖速度不僅與培養(yǎng)基的類型有關(guān)，更受到營養(yǎng)條件的限制。

(2)不同類型的培養(yǎng)基接入解磷根瘤菌SL01并充分發(fā)酵之后，發(fā)酵液的pH值都相當(dāng)程度的偏離了初始的酸堿度，這與梁錦峰[15]的研究結(jié)果不同，即溶磷菌培養(yǎng)物的終點pH值與初始pH值無明顯的變化。這可能除了菌株本身原因外，合適的碳氮比也是一個非常重要的因素。碳氮比高的培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后pH值常會明顯下降，而碳氮比低的培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后其pH則會明顯上升[16]。Wenzelet[17]的研究表明，溶磷桿菌只有在培養(yǎng)基的pH下降到4左右時具有強(qiáng)烈的溶磷活力，而當(dāng)培養(yǎng)基pH升高時則失去溶磷活性。以上結(jié)論表明，要使SL01菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力，充足的碳源是不可或缺的。其具體的變化過程仍有待進(jìn)一步的研究。此外，根瘤菌作為好氣菌，發(fā)酵培養(yǎng)的透氣條件對菌株的增殖能力及菌種的活性密切相關(guān)，在解磷根瘤菌的發(fā)酵培養(yǎng)中，透氣狀況應(yīng)作為重要的環(huán)節(jié)進(jìn)行考慮。

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