武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 韓 杰 劉玉蘭* 洪 宇 吳志鋒

在豬的生產(chǎn)中，免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、斷奶應(yīng)激、大量接觸病原微生物等因素易導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)生免疫抑制（袁書林，2006），從而降低其生長(zhǎng)性能，增加其疾病易感性和死亡率。目前，環(huán)磷酰胺（CY）是各種免疫抑制藥物中作用最強(qiáng)、應(yīng)用最廣泛的藥物之一。大量動(dòng)物試驗(yàn)證明，CY可抑制機(jī)體免疫功能（He等，2007； 趙戈清等，2005；El-Abasy等，2004）。但是，由于CY的藥理功效復(fù)雜，對(duì)不同動(dòng)物的毒作用劑量、毒作用點(diǎn)和毒作用程度均不同，且在豬上的模型較少，本試驗(yàn)用CY構(gòu)造仔豬免疫抑制模型，從細(xì)胞免疫、體液免疫、細(xì)胞因子釋放等方面觀察了仔豬免疫功能的變化，旨在為仔豬免疫增強(qiáng)劑的研究和開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CY為蘇州尤利特生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，純度 ≥99.3%；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG、刀豆蛋白A（Con A）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、植物血凝素（PHA）、卵清蛋白（OVA）均為Sigma產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分層液為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）為Roche產(chǎn)品；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用12頭（28±3）d的杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬，預(yù)試1周，按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將其分為對(duì)照組和CY組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。試驗(yàn)期14 d。第1天和第7天，給CY組仔豬注射50 mg/kg BW的CY，對(duì)照組仔豬注射等量的生理鹽水。另外，第1天所有仔豬從耳后肌肉注射BSA（終濃度1 mg/kg BW）。參照NRC（1998）斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 血液樣品采集 于試驗(yàn)的第7天和第14天，從仔豬的前腔靜脈采血：用非抗凝真空管采血，3500 r/min離心10 min后，分離血清，測(cè)定血清BSA抗體、IgG及細(xì)胞因子含量；用EDTA K3抗凝采血管采血1 mL用于白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；用肝素抗凝真空管采血7 mL，測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的測(cè)定 血液白細(xì)胞含量及其分類計(jì)數(shù)采用日本Sysmex K4500血液自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.4.2 細(xì)胞免疫的測(cè)定 通過(guò)測(cè)定遲發(fā)型超敏反應(yīng)和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來(lái)反映仔豬細(xì)胞免疫功能。

1.4.2.1 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管采血7 mL。取10 mL離心管加淋巴細(xì)胞分層液4 mL，然后沿管壁緩緩疊加血3 mL，2500 r/min離心30 min，取中間白細(xì)胞部分， 用3～5倍體積無(wú) Ca2+、Mg2+Hank’s液洗 3次，每次2000 r/min離心10 min。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（＞95%），調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×106個(gè)/mL。然后將淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入Con A（終濃度為8 μg/mL）；另一組加入等體積的培養(yǎng)液為對(duì)照，培養(yǎng)體系為每孔200 μL。置5%CO2、37℃培養(yǎng) 72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前 6 h，每孔加入10 mL MTT（初始濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入100 μL 10%SDS-0.04 mol/L HCl溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm下測(cè)定OD值。

1.4.2.2 遲發(fā)型超敏反應(yīng) 參照Kornegy等（1989）的方法，在仔豬左腿內(nèi)側(cè)距最后乳頭5 cm及距腹中線5 cm處皮下注射0.1 mL PHA（150 μg/0.1 mL），右側(cè)對(duì)稱部位注射等量的生理鹽水，24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)定雙側(cè)注射部位皮褶厚度的變化。

1.4.3 體液免疫的測(cè)定 通過(guò)測(cè)定血清免疫球蛋白G（IgG）和BSA抗體水平來(lái)反映仔豬體液免疫功能。

IgG水平用免疫比濁法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品）說(shuō)明書進(jìn)行。

BSA抗體水平用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定的操作程序進(jìn)行：BSA抗原用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至 10 μg/mL，包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜，洗滌液（0.01 mol/L pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液中加0.05% 吐溫20）洗板3次，然后每孔加封閉液（PBS中加 0.03%OVA）200 μL，37℃封閉2 h。洗板3次后，將稀釋好的血清（1∶80）加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，另取陰性血清稀釋后作負(fù)對(duì)照，37℃溫育1 h。洗板3次，加入1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG，每孔100 μL室溫下反應(yīng)1 h。洗板3次后，每孔加入100 μL新配制的TMB底物顯色液，室溫下反應(yīng)15 min。顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)，每孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值。

1.4.4 細(xì)胞因子的測(cè)定 干擾素-γ（IFN-γ）采用豬的ELISA試劑盒（R&D Systems Inc.）方法測(cè)定；白細(xì)胞介素2（IL-2）采用豬的ELISA試劑盒方法（Uscnlife Science and Technology Co.）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t-檢驗(yàn)分析CY組和對(duì)照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.10表示具有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 由表2可知，CY顯著降低第14天斷奶仔豬的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量（P<0.05），并且具有降低第7天嗜中性粒細(xì)胞和第14天單核細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)（P<0.10）。

表2 環(huán)磷酰胺刺激對(duì)斷奶仔豬白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響

2.2 細(xì)胞免疫 由表3可知，CY對(duì)Con A誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和PHA刺激的皮褶厚度無(wú)顯著影響。

表3 環(huán)磷酰胺刺激對(duì)斷奶仔豬細(xì)胞免疫的影響

2.3 體液免疫 由表4可知，CY對(duì)IgG和第7天斷奶仔豬的BSA抗體水平無(wú)影響，但顯著降低了第14天BSA抗體水平（P<0.05）。

表4 環(huán)磷酰胺刺激對(duì)斷奶仔豬體液免疫的影響

2.4 細(xì)胞因子 由表5可知，CY對(duì)IL-2及第14天的IFN-γ水平無(wú)影響，但顯著降低第7天的IFN-γ 水平（P<0.05）。

表5 環(huán)磷酰胺刺激對(duì)斷奶仔豬細(xì)胞因子的影響

3 討論

CY是一種烷化劑，臨床上主要用于治療腫瘤自身免疫性疾病和器官移植等，其在體外無(wú)活性，進(jìn)入體內(nèi)，可在肝微粒體酶的作用下，分解出烷化作用很強(qiáng)的氯乙基磷酞胺，并與細(xì)胞內(nèi)DNA交練結(jié)合，通過(guò)與DNA雙鏈交叉連接破壞DNA，從而破壞免疫活性細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。因此，研究上常用大劑量的CY來(lái)構(gòu)建動(dòng)物免疫抑制模型（許愛(ài)華等，2008；董曉芳等，2007；He等，2007）。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病時(shí)都可引起白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞的百分比發(fā)生變化。因此，白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)是反映豬的免疫狀況的常用指標(biāo)之一（Tan等，2009）。本試驗(yàn)中，CY可降低第7天的中性粒細(xì)胞數(shù)及第14天的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)，表明仔豬的免疫功能受到一定程度的抑制。這與孫月平等（1999）、王盛民等（2006）、張炳華和劉新軍（2008）的研究結(jié)果類似。

本試驗(yàn)中，從遲發(fā)型超敏反應(yīng)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率這兩個(gè)指標(biāo)可以看出，CY對(duì)細(xì)胞免疫功能無(wú)顯著影響，這與袁書林（2006）、Hou 等（2007）和陳慶（2008）的結(jié)果不一致。這可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)動(dòng)物種類和健康狀況、試驗(yàn)動(dòng)物自身細(xì)胞免疫功能水平、CY的注射劑量及注射方式等不同有關(guān)。

BSA為一種異源蛋白抗原，具有胸腺依賴性，其抗體產(chǎn)生需要Th細(xì)胞的協(xié)助。免疫前仔豬血清中BSA抗體水平應(yīng)為零，在經(jīng)過(guò)抗原BSA刺激后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，更多的蛋白質(zhì)用于抗體的合成，抗體水平升高。本試驗(yàn)中，CY顯著降低了第14天BSA抗體水平，這與He等（2007）的結(jié)果一致，表明CY抑制了仔豬的體液免疫功能。

根據(jù)細(xì)胞因子產(chǎn)生的不同，CD4+的Th細(xì)胞可分為Th1和Th2亞群。Th1分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，提升機(jī)體免疫效應(yīng)；Th2分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，參與免疫抑制或免疫耐受（Raymond和 Wilkie，2004）。 在體內(nèi)，Th1 和 Th2 以及相應(yīng)的細(xì)胞因子含量的變化往往意味著機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，Th1及IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的增加意味著機(jī)體免疫上調(diào)，Th2及IL-4、IL-10等因子的增加往往意味著免疫耐受或免疫下調(diào)（Ichiyama等，2006）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CY可降低第7天的IFN-γ水平，這與何榮（2005）與彭廣華（2007）的報(bào)道一致。該結(jié)果提示：CY可抑制仔豬體內(nèi)同源淋巴細(xì)胞活化，誘導(dǎo)分泌IFN-γ等細(xì)胞免疫上調(diào)因子的Th1減少，意味著機(jī)體免疫水平受到抑制。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)表明，CY降低了斷奶仔豬白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量及BSA抗體和IFN-γ水平，使其免疫功能受到一定程度的抑制，但其對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無(wú)影響。有關(guān)CY對(duì)斷奶仔豬細(xì)胞免疫功能的影響仍需要進(jìn)一步研究，進(jìn)而確定CY最佳劑量和注射方式。

[1]陳慶.“芪苓”制劑對(duì)免疫抑制小鼠作用機(jī)理的研究：[碩士學(xué)位論文][D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[2]董曉芳，汪仕奎，薩仁娜，等.免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能及其內(nèi)分泌的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（9）：993 ～998.

[3]何榮.益氣清瘟片對(duì)免疫低下小鼠T細(xì)胞亞群和IL-2、IFN-γ影響的實(shí)驗(yàn)研究：[碩士學(xué)位論文][D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[4]彭廣華.從Th1/Th2漂移探討千佛菌對(duì)環(huán)磷酰胺模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用：[碩士學(xué)位論文][D].咸陽(yáng)：陜西中醫(yī)學(xué)院，2007.

[5]孫月平，王金寶，張樂(lè)萃，等.黃芪多糖對(duì)免疫抑制雞某些免疫指標(biāo)影響的研究[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，16（1）：61 ～63.

[6]王盛民，侯新江，張瑛.膨化麥冬對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].陜西中醫(yī)，2006，27（3）：368 ～370.

[7]許愛(ài)華，任莉，鄭媛媛，等.銀杏外種皮多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2008，22（1）：69～72.

[8]袁書林.黃芪多糖對(duì)斷奶仔豬免疫調(diào)控作用及其機(jī)理：[博士學(xué)位論文][D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[9]張炳華，劉新軍.青春雙歧桿菌對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（2）：153 ～156.

[10]趙戈清，羅霞，陳東輝，等.不同劑量環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)正常小鼠免疫抑制的對(duì)比研究[J].免疫學(xué)雜志，2005，21（3）：122 ～124.

[11]El-Abasy M，Motobu M，Nakamura K，et al.Preventive and therapeutic effects of sugar cane extract on cyclophosphamide-induced immunosuppression in chickens[J].Int Immunopharmacol，2004，4：983 ～990.

[12]He X，Yang X J，Guo Y M.Effects of different dietary oil sources on immune function in cyclophosphamide immunosuppressed chickens[J].Anim Feed Sci Tech，2007，139：186 ～200.

[13]Hou F X，Yang H F，Yao T，et al.The immunosuppressive effects of 10 mg/kg cyclophosphamide in Wistar rats[J].Environ Toxicol Pharmacol，2007，24：30 ～36.

[14]Ichiyama T，Siba P，Suarkia D，et al.Analysis of serum and cerebrospinal fluid cytokine levels in subacute scierosing panencephalitis in Papua New Guinea[J].Cytokine，2006，33（1）：17 ～20.

[15]Kornegay E T，van Heugten P H G，Lindemann M D，et al.Effects of biotin and high copper levels on performance and immune response of weanling pigs[J].J Anim Sci，1989，67：1471 ～1477.

[16]NRC.Nutrient Requirements of Swine[M].10th Ed，National Academic Press，Washington D C，1998.

[17]Raymond C R，Wilkie B N.Th-1/Th-2 type cytokine profiles of pig T-cells cultured with antigen-treated monocyte-derved dendritic cells[J].Vaccine，2004，22：1016 ～1023.

[18]Tan B E，Li X G，Kong X F，et al.Dietary L-arginine supplementation enhances the immune status in early-weaned piglets[J].Amino Acids，2009，37（2）：323 ～331.