河北省邢臺市人民醫(yī)院 解慶凡 王建華 張一昕 王曉貞 郭文平 （邢臺 054031）

脂脈寧為課題組在長期臨床實踐過程中自行研制的治療酒精性脂肪肝 （AFL）的有效中藥制劑,經(jīng)多年臨床運用證實,療效確切。[1]據(jù)報道,細胞因子的啟動和致敏是脂肪肝肝損害中的關(guān)鍵一步。[2]為了探討脂脈寧的作用機理,筆者觀察了其對 AFL模型大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影響。

1 材料

1.1 動物 健康 wistar大鼠 70只,♂,清潔級,體重160～180 g,購自河北省實驗動物中心 （合格證號:1003046）。

1.2 藥物 脂脈寧組成:澤瀉、姜黃、山楂、石菖蒲、皂角、大黃、何首烏等。由我院制劑室制成膠囊制劑,實驗時用蒸餾水配制成所需濃度。東寶肝泰片:通化東寶藥業(yè)股份有限公司出品,批號為 H 22024764。實驗時用 0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。

1.3 試劑來源 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、總膽固醇 （TC）、甘油三酯 （TG）試劑盒均由北京中生生物工程高技術(shù)公司提供,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素 8（IL-8）放免試劑盒均購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所,膽固醇、膽鹽均購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司,56度紅星二鍋頭白酒 （北京紅星二鍋頭酒廠生產(chǎn)）。

1.4 主要儀器 半自動生化分析儀 （德國毫邁克公司）、FJ-2020型 γ射線免疫計數(shù)器 （國營 262廠）、MSE-25型高速冷凍離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 方法

2.1 動物分組 將 70只健康雄性 wistar大鼠,飼養(yǎng)于18℃～22℃明暗各 12 h的清潔級動物實驗室內(nèi),正常喂養(yǎng)1周后,按體質(zhì)量隨機分為5組,即:正常對照組 （簡稱正常組）、模型對照組 （簡稱模型組）、脂脈寧高、低劑量組（簡稱高、低劑量組）、東寶肝泰對照組（簡稱對照組）。除正常組 10只外,其余各組均為 15只。

2.2 造模與給藥 正常組用蒸餾水灌胃,進食普通飼料,自由飲水。其余各組參照相關(guān)文獻[3-4]加以改良,用56%紅星二鍋頭灌胃,濃度從 30%逐漸升至 56%,梯度為每周升高 5%,于第 6周直接升至 56%,并持續(xù)至第 8周,同時喂飼高脂飼料 （由 1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和 88%基礎(chǔ)飼料制成）,自由飲水。大鼠造模的同時給藥治療,正常組和模型組給予蒸餾水灌胃,脂脈寧高、低劑量組和對照組分別給予相應(yīng)藥物灌胃。1次/d,每次用藥體積均按 1mL/100 g計算,持續(xù) 8周。

2.3 標(biāo)本處理 實驗8周末,于最后 1次給藥后禁食 12 h麻醉狀態(tài)下取血,將血樣低溫離心,分離血清,密封,-20℃冷存待檢。取血后迅速剖取肝臟,在肝臟最大葉距邊緣 0.5 cm處取 0.5×0.5 cm大小肝組織,用 4%的多聚甲醛固定。另取適量肝組織用冰生理鹽水沖洗,濾紙吸濕后,稱取濕重 0.3 g左右,加入預(yù)冷的生理鹽水,冰水中制成 10%勻漿,4℃4 000 r/min離心 10m in,提取上清液,-20℃冷存待檢。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察:取用 4%的多聚甲醛固定肝組織,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4.2 血脂和肝功能檢測:取血清在半自動生化分析儀上測定 TC、TG、AST、ALT

2.4.3 血清TNF-α和 IL-8的測定:采用放射免疫法,嚴格按試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色后光鏡下觀察:正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈大而壁薄,肝細胞排列成肝索,在中央靜脈周圍呈放射狀分布,細胞呈多邊形,無濁腫、壞死,胞漿無脂滴,無炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清,肝細胞索紊亂,肝竇變窄,多數(shù)肝細胞濁腫、明顯脂肪變性,脂滴以大泡型為主,可見點狀壞死和炎癥細胞浸潤。各治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞脂肪變性明顯好轉(zhuǎn),肝細胞排列整齊,肝竇基本恢復(fù)正常,少量肝細胞濁腫,無炎細胞浸潤和壞死。

3.2 脂脈寧對 AFL大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量異常升高 （P＜0.01）,顯示 AFL大鼠存在著明顯的血脂代謝紊亂和肝功能異常。給藥后,脂脈寧高、低劑量組和對照組均能顯著降低實驗大鼠血清 TC、TG、ALT、AST的含量,與模型組比較差異均具有顯著性 （P＜0.05或 P＜0.01）。其中,高劑量組明顯優(yōu)于對照組 （P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果詳見表 1。

表1 各組大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的變化情況 （±s）

表1 各組大鼠血清 TG、TC、AST、ALT的變化情況 （±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01,**P＜0.05;與對照組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 TG（mmol/L） TC（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L）正常組 0.78±0.11* 1.47±0.16* 56.51±7.68* 81.33±9.59*模型組 1.69±0.16 3.65±0.32 125.36±13.93 207.52±15.82高劑量組 0.81±0.13*△△ 1.63±0.21*△ 44.27±6.38*△ 104.71±9.28*△△低劑量組 0.96±0.12* 1.65±0.26*△ 52.38±5.83* 130.73±11.02*對照組 1.02±0.17* 1.98±0.25* 57.62±8.01* 136.56±10.48*

3.3 脂脈寧膠囊對 AFL大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清 TNF-α和IL-8的含量均較正常組異常升高 （P＜0.01）;給藥后各治療組大鼠血清 TNF-α和 IL-8的含量均低于模型組 （P＜0.01）;其中,高、低劑量組血清TNF-α含量均低于對照組;高劑量組血清 IL-8含量低于低劑量組和對照組 （P＜0.05）。結(jié)果詳見表 2。

表2 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比較 （±s）

表2 各組大鼠血清 TNF-α和 IL-8含量的比較 （±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01;與對照組比較,△P＜0.05;與高劑量組比較,▲P＜0.05

分組 TNF-α（ng/mL） IL-8（pg/mL）正常組 0.93±0.15* 195.78±15.34*模型組 1.76±0.26 268.76±26.15高劑量組 1.09±0.23*△ 130.81±11.55*△低劑量組 1.13±0.18*△ 179.46±21.66*▲對照組 1.39±0.21* 186.82±19.31*

4 討論

AFL在中醫(yī)學(xué)中無獨立的病名,根據(jù)其病因、病機及臨床表現(xiàn),可歸屬于中醫(yī)學(xué)的 “酒疸、脅痛、傷酒、酒癖、酒脹、酒勞、積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為酒為濕熱有毒之邪氣,味甘、苦、辛,性溫,有毒;歸心、肝、脾、胃經(jīng)。過量飲用則酒毒濕熱蘊結(jié)于中焦,損傷脾胃,濕濁內(nèi)生,聚濕生痰,痰阻氣滯,肝失疏泄,氣滯血瘀,痰濕瘀毒相搏,結(jié)于脅下而成此病。病情纏綿不愈,日久則耗傷肝腎之陰。因此濕熱痰瘀互結(jié),肝脾失調(diào)為 AFL的主要病機,故脂脈寧選用澤瀉利濕消痰、泄熱;皂角祛痰散結(jié);姜黃、山楂疏肝行氣、祛瘀通絡(luò);石菖蒲、白術(shù)祛濕健脾;大黃通腑導(dǎo)滯,排除濕毒瘀積;何首烏補肝腎、益精血。諸藥合用,共奏除濕泄熱、疏肝活血、健脾益腎之功。

肝臟是人體的重要解毒器官,酒精的解毒代謝過程主要在肝臟中進行,長期大量攝入酒精性飲品,酒精代謝產(chǎn)物直接刺激肌體產(chǎn)生內(nèi)毒素,肝內(nèi)蓄積的酒精及其氧化代謝產(chǎn)物可直接刺激肌體產(chǎn)生內(nèi)毒素。血中內(nèi)毒素升高,刺激激活肝臟 Kupffer細胞產(chǎn)生大量核轉(zhuǎn)錄因子,如 NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素 E2（PGE2）等。NF-κB誘導(dǎo)激活肝臟 Kupffer細胞,釋放大量IL-6、IL-8等炎癥因子。TNF-α可直接引起肝細胞脂肪變性、炎癥及肝細胞壞死。[2]IL-8為中性粒細胞活化及趨化性刺激因子,可促使炎癥細胞,如活化的中性粒細胞聚集至肝臟,引起炎癥。TNF-α還可以誘導(dǎo) IL-6、IL-8等細胞因子的釋放,促進肝細胞內(nèi)中性粒細胞浸潤,并通過脂質(zhì)過氧化使細胞受損,最終導(dǎo)致細胞死亡。酒精性肝病患者血清 IL-8濃度與肝臟內(nèi)浸潤中性粒細胞的數(shù)目密切相關(guān),臨床研究表明,ALD病人血清中 IL-8水平明顯高于正常人。[5-6]本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA、TNF-α和 IL-8的含量明顯升高,鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞索紊亂,肝細胞呈大泡樣脂肪變性,并可見壞死灶和炎癥細胞浸潤。經(jīng)過藥物治療后,血清中 TC、TG、AST、ALT、TNF-α和 IL-8的含量明顯降低,肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善。這種抑制細胞因子的分泌和釋放,調(diào)節(jié)免疫的作用,可能是脂脈寧治療AFL的作用機制之一。

[1] 王曉貞.脂脈寧治療酒精性脂肪肝臨床療效觀察 [1].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010,12（2）:60-61

[2] 韓婷,井源,吳靜,等 .酒精性脂肪肝的肝損傷機制研究近況 [1].實用肝臟病雜志,2007,10（4）:279-281

[3] 古賽,蔣小黎,何琳,等 .大鼠慢性酒精性脂肪肝模型的建立 [J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,31（1）:81

[4] 朱衛(wèi)豐,趙益,許可冀,等.東寶肝泰片防治大鼠酒精性脂肪肝的作用及機制研究 [J].中國藥房,2009,20（28）:2 179-2 181

[5] 楊牧祥,田元祥,姚樹坤,等 .解酒護肝飲對酒精性肝損傷大鼠血清和肝組織 MDA、GSH的影響 [J].河北中醫(yī)藥學(xué)報,2000,15（4）:1-5

[6] 莫成林,李燕.細胞因子在酒精性肝炎中的作用 [J].國外醫(yī)學(xué)?藥學(xué)分冊,2003,30（3）:171-174

（2010-11-18 收稿）