金玉玲,陸曉紅,綦 瑩,羅海龍,吳盛華,陸春風

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.哈爾濱市兒童醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150000;3.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江 157006;4.佳木斯市中心醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)

NSCs攜帶外源基因治療為神經系統(tǒng)疾病變的治療及機制探討提供了廣闊的前景[1],為揭示神經系統(tǒng)中各種轉錄因子作用相關機制等問題提供了良好的實驗模型。擴增 AdHIF-1α--GFP后轉染 NSCs,免疫細胞化學染色法檢測轉染后 N SCs基因表達情況、V EGF和 NF-κ B的表達情況及給予梯濃度 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC后 AdHIF-1α--GFP修飾后 NSCs中 VEGF的表達情況。從而進一步認識HIF-1α在 CI后信號轉導途徑 ,為深入了解 NF-κB在發(fā)揮腦保護效用中的作用機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑

DMEM/F12、B27(為 Gibico產品),人基因重組表皮生長因子(EGF)、人堿性纖維生長因子(bFGF)(為 Invitrogen產品 ),兔抗 Nestin多克隆抗體、羊抗兔 IgG-CY3、兔抗HIF-1 α多克隆抗體、兔抗 NF-κB多克隆抗體、兔抗 V EGF多克隆抗體(北京博澳森),SABC(大鼠)試劑盒,HIF-1α質粒在 Ad載體中并帶有 GFP標記 ,空載體 Ad帶有 GFP標記(由重慶醫(yī)科大學胡長林教授饋贈),HEK293-細胞33代次(北京本元正陽)。

1.2 方法

1.2.1 進行細胞培養(yǎng)

取新生 24h內的 Wistar大鼠,無菌取出海馬,Hanks液漂洗剪碎后吹打,用 200目篩網過濾后1000r/min離心5min,棄上清,加入完全 N SCs培養(yǎng)液1mL,吹打成細胞懸液,接種于細胞培養(yǎng)瓶中,放置37℃,5%的 CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每隔2d換液。7d后傳代,傳3代后備用。參考蔡文琴等[2]方法,采用免疫細胞化學法和熒光法進行 nestin染色鑒定是否為N SCs[3]。

1.2.2 AdHIF-1α--GFP及空 Ad--GFP的擴增

取細胞密度 70%左右 33代 HEK293細胞,PBS5mL沖洗1次;取 1mL AdHIF-1 α--GFP平鋪加入培養(yǎng)瓶,并左右微斜,使其均勻平鋪瓶底,放入細胞培養(yǎng)箱孵育2h后加入2%細胞維持液2mL孵育24h后,90%以上細胞變圓且漂浮,在熒光顯微鏡下觀察,475nm波長藍光激發(fā)光下觀察508nm的綠色熒光。并在熒光顯微鏡下成像,將細胞懸液三凍三融后5000r/5min離心,0.22濾器抽濾后分裝 EP管于-80℃冰箱凍存。采用細胞計數及 MTT方法用 Reed-Muench法計算病毒滴度及感染復數。

1.2.3 檢測基因轉染后 NSCs中 HIF-1 α表達

熒光檢測 N SCs中 AdHIF-1 α--GFP及空載體 Ad-GFP表達,分別提取基因轉染后 N SCs、空載體轉染 NSCs、正常 N SCs蛋白做免疫細胞化學染色法[4]檢測 HIF-1 α表達。

1.2.4 檢測各組 NSCs中 N F-κB和 V EGF表達

分別提取基因轉染后 N SCs、空載體轉染 NSCs、正常NSCs蛋白做免疫細胞化學染色法檢測 NF-κ B和 V EGF表達。

1.2.5 檢測給予 NF-κ B梯濃度抑制劑后基因轉染 N SCs中 V EGF表達

HIF-1α基因修飾的 NSCs中按 50μ mol/L、 150μmol/L、300 μmol/L濃度梯度加入特異性抑制劑二硫氨基甲酸酞吡咯烷(PDTC)[5],免疫細胞化學染色法檢測其中 V EGF的表達變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據用平均數±標準差 (±s)表示 ,采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及t檢驗統(tǒng)計學處理。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 免疫組化檢測基因轉染后神經干細胞中 HIF-1α表達

免疫細胞化學顯示,HIF-1 α染色可見幾乎所有細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒,胞核呈藍色,構成的細胞集落形狀較規(guī)則,呈橄欖球形或球形,但未處理神經干細胞組及空載體神經干細胞組細胞中無HIF-1α染色陽性表達。

2.2 檢測各組神經干細胞中 NF-κB表達結果

見表 1。

表 1 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 N F-κ B表達陽性細胞數比較 (±s,n=6)

表 1 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 N F-κ B表達陽性細胞數比較 (±s,n=6)

*:與空載體組和正常組相比,P ＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 2.31± 0.20 3.65± 0.68 8.30±1.31空載體組 2.57± 0.12 3.52± 0.53 2.57±1.55基因轉染組 8.16± 1.62* 8.75± 0.96* 8.30± 1.21*F 73.37 96.09 94.36

2.3 各組神經干細胞中 VEGF表達結果

見表2。

表2 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 VEGF表達比較 (±s,n=6)

表2 AdHIF-1α--GFP轉染后 NSCs中 VEGF表達比較 (±s,n=6)

*:與空載體轉染組及正常神經干細胞組相比較,P＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 1.83± 0.13 1.26± 0.34 1.10±0.30空載體組 1.70± 0.25 1.54± 0.36 1.36±0.37基因轉染組 9.40± 2.28* 10.57± 3.96* 10.26± 3.15*F 66.49 31.6 48.12

2.4 加入 N F-κB特異性抑制劑后 HIF-1α基因修飾的神經干細胞 V EGF的表達

見表3。

表3 轉染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細胞數比較 (±s)

表3 轉染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細胞數比較 (±s)

1次 2次 3次50 μ mol/L 19.78± 2.46 20.60± 1.65 19.42± 1.83 150μ mol/L 13.93± 1.97 14.12± 2.50 11.80± 1.52 300 μ mol/L 4.67± 0.84 7.25± 2.50 6.84± 1.48 F 97.64 74.66 91.88

300μ mol/L組與 150μ mol/L組相比 ,P＜ 0.05,有顯著差異;50 μ mol/L組 與 150 μ mol/L 組相 比,P＜ 0.05;300 μ mol/L組 與50 μ mol/L組相比P＜ 0.05。

3 討論

HIF-1α是在缺血缺氧條件下發(fā)揮重要作用的轉錄因子,一系列與組織耐受缺血缺氧環(huán)境有關的基因都由它激活轉錄[6]。我們用免疫細胞化學染色的方法顯示轉染 AdHIF-1α-GFP組有 HIF-1α陽性細胞的表達,而 Ad-GFP組和正常 NSCs組無 HIF-1 α陽性細胞的表達,在同樣的反應條件下,AdHIF-1α-GFP組 HIF-1α陽性細胞數明顯高于Ad-GFP組和正常 NSCs組。提示重組的 AdHIF-1α-GFP以轉入神經干細胞并有 HIF-1α的表達。為下一步探討目的基因 HIF-1 α的作用信號轉錄機制做了良好的鋪墊。

很多研究發(fā)現(xiàn),在腦缺氧損傷區(qū)域 N F-κ B與 V EGF表達呈正相關[7]。因此,我們大膽假設,NF-κ B是否處于 HIF-1α上調 V EGF作用通路上并起重要作用。本實驗設計為以 HIF-1α修飾的 NSCs為載體,給予抑制 NF-κ B生物活性后檢測 V EGF的表達,為排除不確定的影響因素,使用國內外公認的 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸酯,pyrrolidindithiocarbamate)[8],以實現(xiàn)特異性抑制N F-κB表達的目的。PDTC是一種抗氧化劑,能有效抑制N F-κB活性及表達。作用原理主要通過兩方面:一是抑制N F-κ B的 p65亞單位,一是通過其金屬螯合作用。免疫細胞化學染色顯示 HIF-1α修飾的 NSCs給予梯濃度 PDTC后,VEGF陽性細胞數呈梯濃度依賴性下調,各濃度組陽性細胞表達數間有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05)。符合我們最初的猜想。

本實驗通過體外培養(yǎng) HIF-1α基因修飾的 N SCs,采用免疫細胞化學染色實驗方法研究 HIF-1α修飾 N SCs后各種轉錄因子表達 ,有助于我們認識 HIF-1α在 CI后信號轉導途徑,對 CI的治療有著積極而重要的指導意義。

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