桂 嶸,李登清,聶新民,劉 競

IL-5主要是由 Th2類淋巴細胞產(chǎn)生的特異作用于嗜酸粒細胞凋亡的細胞因子。近年研究表明,哮喘患者和寄生蟲感染者血清 IL-5水平往往升高[1-2]。然而,對 IL-5 mRNA在各種肝損傷患者中的表達狀況了解甚少。為此,本研究采用半定量反轉(zhuǎn)錄 -多聚酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法,對慢性肝病、急性重型肝炎和原發(fā)性肝癌患者外周血單個核細胞 (PBMCs)中的 IL-5mRNA表達水平進行檢測,并探討肝損傷患者 PBMCs中 IL-5mRNA的表達水平與血清膽紅素水平、內(nèi)毒素血癥及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2008年 2—10月在我院住院的慢性肝病患者 36例 (慢性乙型肝炎 21例,慢性丙型肝炎15例),其中男 23例,女 13例,年齡 26～52歲,平均 38.7歲;急性重型肝炎患者 17例,其中男 8例,女 9例,年齡 22～50歲,平均36.2歲;原發(fā)性肝癌 11例,其中男 6例,女 5例,年齡 38～62歲,平均 48.9歲。診斷均符合北京 1995年全國傳染病和寄生蟲病學(xué)術(shù)會議修訂的標準。另選擇 18例在我院進行體檢的健康者為對照組,其中男 10例,女 8例,年齡 26～50歲,平均 38.2歲。所有受檢者在抽血前未使用過糖皮質(zhì)激素類等影響免疫功能的藥物。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集與處理 抽取患者或健康者外周靜脈血 6 Ml,用肝素抗凝。用淋巴細胞分離液分離 PBMCs,用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液 (10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素)稀釋,將細胞數(shù)調(diào)整至 2×106/ml,臺盼藍染色,細胞活力 ＞95%,種入 24孔細胞培養(yǎng)板,加入植物血凝素 (PHA),終濃度為 100μg/ml,置 37℃、體積分數(shù)為 0.05的二氧化碳 (CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h,2 000 r/min,離心10 min后收集上清和細胞,分別于 -20℃、-70℃保存待測。

1.2.2 RT-PCR

1.2.2.1 總 RNA抽提 按照 TrizolTMReagent說明書提取總RNA,要求所提 RNA經(jīng)紫外分光光度儀分析 A260/A280≥1.8且質(zhì)量分數(shù)為 0.01的 RNA,甲醛變性凝膠電泳證實 28S和18S真核細胞 RNA比值約為 2∶1。

1.2.2.2 引物選擇與合成 IL-5正鏈引物序列:5′-ACCTTGGCACTGCTTTCTA-3′,負鏈引物序列:5′-GCAAAGTGTCAGTATGCCT-3′;β肌動蛋白 (β-actin)正鏈引物序列:5′-AAGGACTGCTACGTCGG-3′, 負 鏈 引 物序列:5′-AGCGACATACATGGCAGG-3′。擴增片段分別為459 bp和 258 bp,以上引物采用 Primer5.0設(shè)計,由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2.3 cDNA合成 以所抽提 RNA為模板,Oligo dT為引物,在 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 (美國 Promego公司)作用下合成 cDNA。25μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,37℃反應(yīng) 1 h。反應(yīng)產(chǎn)物于 94℃滅活 5 min。

1.2.2.4 基因擴增 50μl PCR反應(yīng)體系加入:10×dNTP 5 μl,5×PCR buffer 10μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μl,IL-5引物和 βactin(第 5個循環(huán)后加入)引物各 1μl,TaqDNA聚合酶 5 U,加去離子水補至 50μl。94℃預(yù)變性 3 min,進入 PCR循環(huán):94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃ 60 s,30個周期,72℃延伸 5 Min。

1.2.2.5 取 PCR反應(yīng)產(chǎn)物 5μl加適量溴酚藍,1%瓊脂糖凝膠電泳,在電腦凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的灰度,以特異性IL-5帶的灰度與 β-actin的灰度之比表示 IL-5 mRNA的表達水平。

1.2.3 血清膽紅素在 HITACHI 7170A全自動生化分析儀上進行檢測;采用凝膠法鱟試驗定性檢測內(nèi)毒素 (試劑為上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品),在去熱原處理過的玻璃小試管中加入鱟試劑和標本各 0.1 ml,混合,置于 37℃水浴 1 h后,將試管倒轉(zhuǎn)凝膠不變形者為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s)表示,多組間計量資料的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用 q檢驗;兩組計量資料的比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各種肝損傷患者 PBMCs中 IL-5 mRNA和 β-actin擴增電泳結(jié)果見圖 1。在電腦凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的灰度,對照組、慢性肝病組、急性重型肝炎組、原發(fā)性肝癌組受檢者PBMCs中 IL-5mRNA的表達水平分別為 (0.0223±0.0047)、(0.1611±0.1035)、 (0.2838±0.0537)和 (0.3313±0.1348),4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=37.25,P＜0.01)。慢性肝病組、急性重型肝炎組和原發(fā)性肝癌組患者 PBMCs中IL-5mRNA的表達水平均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為 4.953、4.518和 5.127,P均 ＜0.01);急性重型肝炎組和原發(fā)性肝癌組 IL-5 mRNA表達水平亦顯著高于慢性肝病組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q值分別為 6.526和 7.773,P＜0.01);而原發(fā)性肝癌組與急性重型肝炎組 IL-5mRNA表達水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.458,P=0.166)。

64例肝損傷 (36例慢性肝病,17例急性重型肝炎,11例原發(fā)性肝癌)患者中,血清膽紅素≥342μmol/L者 25例,膽紅素 ＜342μmol/L者 39例,二者 PBMCs中 IL-5 mRNA表達水平分別為 (0.3092±0.0975)和 (0.1677±0.1024),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=5.74,P＜0.01);內(nèi)毒素 (+)和 (-)者各 32例,二者 PBMCs中 IL-5 mRNA表達水平分別為(0.3101±0.0950)和 (0.1358±0.0732),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=8.28,P＜0.01);死亡 10例,存活 54例,死亡者與存活者 PBMCs中 IL-5 mRNA表達水平分別為 (0.3352±0.1401)和 (0.2022±0.1069),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=3.41,P＜0.01)。

圖 1 肝損傷患者及健康者PBMC中 IL-5mRNA和 β-actin擴增電泳圖Figure 1 Electrophoresisof IL-5mRNA andβ-actin amplifier fragment in the patientswith liver injury and healthy controls