黃作義,許志剛,吳成吉,張曉梅,朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是發(fā)生于老年和老年前期,以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,是老年期癡呆的最常見(jiàn)類(lèi)型,約占老年期癡呆的50%。臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算能力損害、人格和行為的改變等。截止 2006年,全球癡呆患者約有 2430萬(wàn)(我國(guó) 500萬(wàn) ),每年新發(fā)病例460萬(wàn)(我國(guó) 30萬(wàn)),且每年翻一番。各國(guó)調(diào)查趨勢(shì)匯總顯示,癡呆患病率在 2%～ 7%,女性多于男性[1]。N F-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)可將信息從胞漿傳至細(xì)胞核并引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,活化后可調(diào)控眾多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá),調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞。遠(yuǎn)志是著名的益智藥物,遠(yuǎn)志藥草的命名就集中地體現(xiàn)了益智強(qiáng)記的主要功能,始載《神農(nóng)本草經(jīng)》,至今,中醫(yī)臨床實(shí)踐已近兩千年。本實(shí)驗(yàn)以海馬區(qū)注射 A β25-35建立的 AD模型大鼠為研究對(duì)象,從 NF-κB活化角度探討遠(yuǎn)志對(duì) AD的防治作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí) Wistar大鼠 96只 ,雄性 ,體重 250～ 300g,由佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

遠(yuǎn)志:由哈爾濱三九藥業(yè)生產(chǎn),1g相當(dāng)于6g飲片。

1.3 主要試劑

A β 25-35(武漢博士德生物工程有限公司),NF-κBp65激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒 (碧云天生物技術(shù)研究所),兔抗大鼠 P-I κ B α抗體 (上海迪奧生物技術(shù)有限公司),兔抗大鼠 IκB α、SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB染色試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

單臂腦立體定位儀(M P8000)(深圳瑞沃德生命科技有限公司);Morris水迷宮 (成都泰盟科技有限公司);熒光倒置顯微鏡(IBE2000)(重慶光電儀器有限公司)。

2 方法及檢測(cè)指標(biāo)

2.1 動(dòng)物分組

將96只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組,假手術(shù)組,模型組 ,遠(yuǎn)志低、中、高劑量組共6組,每組16只。

2.2 AD動(dòng)物模型制備

將 A β 25-35肽段 lmg溶于0.5mL滅菌生理水中,濃度為 2 μg/μL,37℃恒溫孵育一周,使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)的 A β,放置于4℃冰箱備用。模型組,遠(yuǎn)志低、中、高劑量組以10%水合氯醛 (0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠;麻醉成功后,立體定位儀固定頭部,顱頂區(qū)備皮,常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚。沿顱頂中線作 2cm切口,分離骨膜使頭骨暴露,參照《大鼠腦立體定位圖譜》,海馬區(qū)定位坐標(biāo):于前囟向后3.0mm,中線左右各旁開(kāi)2.0mm,用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨 ,垂直進(jìn)微量進(jìn)樣器針2.8mm,將5μL溶液緩慢注入,留針5min,以保證溶液充分彌散,然后緩慢撤針,縫合切口皮膚,青霉素肌注8萬(wàn)單位 /次,連續(xù)肌注3d,假手術(shù)組手術(shù)方法相同,注射同體積的生理鹽水。

2.3 給藥方法

用開(kāi)水按比例稀釋成0.083g/mL,0.167g/mL,0.334g/mL低中高三個(gè)劑量組,4℃保存。各組大鼠均按1mL/100g·d。A β注射后第 7天開(kāi)始灌胃給藥 ,連續(xù) 4周。

2.4 各組大鼠海馬區(qū) NF-κB p65的活化

制作腦冠狀石蠟切片,用免疫熒光法測(cè)定海馬區(qū) N F-κB p65核移位情況,所有操作嚴(yán)格按照碧云天生物技術(shù)研究所 N F-κ B激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 各組大鼠海馬區(qū) P- IκB α、 I κ B α的表達(dá)

免疫組化步驟(SABC法),按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,以P＜0.05為顯著性差異水平。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的計(jì)算取每只大鼠腦組織切片3張,每張切片于海馬區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域,在400×顯微鏡下計(jì)算此區(qū)域內(nèi)的免疫組化染色為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),將所得均數(shù)作為每只動(dòng)物的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為統(tǒng)計(jì)資料,結(jié)果以 (±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 海馬區(qū) NF-κB p65的活化

N F-κ B p65呈紅色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光 ,如細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)粉色熒光則表示 N F-κ B進(jìn)入核內(nèi)為陽(yáng)性細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比,假手術(shù)組中 N F-κ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較,其余各組 N F-κB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增加 (P＜0.05)。與模型組比較 ,遠(yuǎn)志各劑量組中 NF-κB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P ＜0.05)。與遠(yuǎn)志低劑量組比較 ,遠(yuǎn)志中、高劑量組中 NF-κB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少 (P＜0.05)。與遠(yuǎn)志中劑量組比較,遠(yuǎn)志高劑量組中 N F-κ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異。

3.2 海馬區(qū) P- IκB的表達(dá)

P-I κ B陽(yáng)性細(xì)胞定位于細(xì)胞漿,呈棕黃色。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比,模型組、遠(yuǎn)志低中劑量組 P-I κ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增加 (P＜0.05),遠(yuǎn)志高劑量組中 P- IκB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異。與模型組相比,遠(yuǎn)志低中高劑量組 P-I κ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著降低 (P ＜0.05)。

3.3 海馬區(qū) I κ B的表達(dá)

Iκ B陽(yáng)性細(xì)胞定位于細(xì)胞漿,呈棕黃色。與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比,其余各組 Iκ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P ＜0.05)。與模型組相比,遠(yuǎn)志低、中、高劑量組, Iκ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加,遠(yuǎn)志高劑量組 Iκ B蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加 (P＜0.05),但仍低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P ＜ 0.05)。

表1 各組對(duì)大鼠海馬區(qū) NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) [±s,例數(shù)(個(gè))]

表1 各組對(duì)大鼠海馬區(qū) NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) [±s,例數(shù)(個(gè))]

注:與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比*P＜0.05;與模型組相比#-P ＜0.05。

組別 N F- κ B p65 P- Iκ B α Iκ B正常對(duì)照組 7.88± 2.42 17.88±5.00 35.13±5.67假手術(shù)組 8.25± 1.91 19.75± 5.01 33.75±6.04模型組 41.38± 5.13* 51.75± 6.99* 13.88±3.23*遠(yuǎn)志低劑量組 32.63±4.96*# 38.00±4.44*# 15.25±2.71*遠(yuǎn)志中劑量組 19.88±4.40*# 25.13±5.36*# 17.38±3.11*遠(yuǎn)志高劑量組 22.13±4.46*# 24.50±3.74# 21.25±3.88*#

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)阿爾茨海默病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前主要有β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)、Tau蛋白學(xué)說(shuō)、遺傳因素學(xué)說(shuō)、慢性炎癥學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等。AD除了具有大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)元缺失、神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑等病理特征以外,還伴隨著一個(gè)緩慢的炎癥病理改變過(guò)程[2]。Bales等也研究發(fā)現(xiàn),用 A β作用于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞后,能以時(shí)間一劑量依賴(lài)型的方式激活 N F-κB,并通過(guò)激活的 N F-κ B上調(diào) IL- lβ和 IL-6的表達(dá)。在 AD病人腦組織切片的免疫組化分析中發(fā)現(xiàn) NF-κ Bp65處于活化形式并且在神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞中處于激活狀態(tài),這些 NF-κB激活的細(xì)胞僅局限于老年斑的附近[3]。NF-κ B是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)可將信息從胞漿傳至細(xì)胞核并引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。沒(méi)有外界刺激時(shí),N F-κB在胞質(zhì)中與其 NF-κB抑制蛋白( IκB)結(jié)合,呈不具活性的狀態(tài)。許多刺激因子均可使 NF-κB活化,在這些因子的作用下,I κ B激酶(IKK)激活,使 I κ B磷酸化,泛素化,降解,從而使 NF-κB活化。NF-κB活化后其 p65亞基上的 NLS暴露,使活化的 NF-κB轉(zhuǎn)移入胞核,并與 DN A的 κ B反應(yīng)元件結(jié)合,從而調(diào)節(jié)特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而由于 I κ B a啟動(dòng)子含有 κ B結(jié)合的位點(diǎn), IκB a的轉(zhuǎn)錄受到 NF κB的調(diào)節(jié),活化的 N F κ B能夠上調(diào) IκBa mNRA水平 ,新合成的 IκBa進(jìn)入核內(nèi)與 NF κ B結(jié)合 ,使其從DN A上解離下來(lái) (NF κ B與 IκB蛋白的親和力高于其與DN A的親和力), IκBa分子中的核輸出序列 N ES(nuclear export signal)再促使 N F κB重新回到細(xì)胞質(zhì)中[4]。遠(yuǎn)志是自古以來(lái)的益智良藥,因此國(guó)內(nèi)學(xué)者用各種 AD模型從行為學(xué)研究、抗氧化、清除自由基、抗炎的作用,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的護(hù)作用及對(duì)中樞膽堿能系統(tǒng)的影響等方面對(duì)遠(yuǎn)志的益智作用進(jìn)行了相關(guān)研究。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明,遠(yuǎn)志能夠抑制 AD模型大鼠海馬區(qū)N F κB活化,這種作用主要是通過(guò)抑制 IκB a降解而不是通過(guò)刺激 IκBa蛋白合成增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的。遠(yuǎn)志減輕 IκB a磷酸化的機(jī)理還需進(jìn)一步探討。

[1]賈建平.神經(jīng)病學(xué) [M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008,214-219

[2]Fiala M,Zhang I,Can X.Amyloid-beta induces chemokine secretion and monocyte migration across a human blood-brain barrer mode[J].Mol Med,1998,4(7):480-489

[3]Bales KR,Du Y,Dodel RC,et al.The NF-kB/Rel family of protei-ns mediates A-beta-induced neurotoxicity and glial activation[J].Brain Res Mol Brain.Res,1998,57(1):63-72

[4]Tak PP,Firestein GS.NF-kappa B:a key role in inflammatory diseases[J].J Clin Invest,2001,107(l):7-11