王緒偉 ,李戰(zhàn)華

(中國科學院力學研究所非線性力學國家重點實驗室,北京100190)

0 引 言

MPT(Multiple-Particle Tracking)也叫多粒子追蹤,是測量粒子布朗運動的一種方法,其原理是連續(xù)記錄多個粒子的運動圖像,通過圖像處理獲取粒子布朗運動位移。粒子布朗運動曾被用于測量Avogadro常數(shù)、Boltzmann常數(shù)等[1-2],近來用于測量細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和流變特性等[3-4],因此MPT方法在膠體科學和生物細胞研究等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。

MPT方法包括圖像采集和圖像處理兩個部分。圖像采集是利用CCD連續(xù)記錄粒子運動圖像。圖像處理可細分為：圖像濾波、粒子識別、粒子匹配和擴散系數(shù)計算4個步驟[5-6]。圖像濾波是為了消除粒子圖像中的背景灰度不均勻和單點噪聲。粒子識別是為了提取光斑位置。粒子匹配是對相鄰兩幀圖像上的粒子進行配對,判斷粒子同一性,以便計算其位移。

目前MPT圖像處理中大多使用Crocker[5]給出的圖像處理算法。粒子識別環(huán)節(jié)是圖像處理的關(guān)鍵,通常采用的單一灰度閾值在識別粒子凝聚團、粒子的衍射光暈等時會出現(xiàn)錯誤。為了剔除“偽粒子”,Crocker[5]曾提出了利用粒子光斑一階矩和二階矩的散點圖,將圖中零零散散的光斑予以剔除。Sbalzarini[7]對錯點剔除辦法進行了改進,提出了選擇剔除粒子量化公式。改進后可以有效剔除粒徑過大或形狀不規(guī)則的粒子,如聚集狀態(tài)的粒子團。Patrik[8]根據(jù)離焦平面越遠粒子衍射圖像越大的原理,提出了剔除非焦平面粒子的辦法,即以粒子光斑的直徑為閾值,濾除偏離焦平面的光斑過大的粒子,并用0.925μ m粒子驗證了此方法有效性。但這一技術(shù)僅剔除非焦平面的粒子,并未包括光斑是否代表真實粒子的判斷。由于納米粒子粒徑小、光強弱,實驗中通常要使用高倍數(shù)的物鏡和高靈敏度的EMCCD。高倍數(shù)的物鏡焦平面較薄,粒子容易形成光暈;而高靈敏度的EMCCD有利于采集微弱的光強信號,但當粒子光斑和光暈的灰度差別不大時,二值化處理中粒子圖像中的衍射光暈容易離散化形“偽粒子”,因此需要探索新的粒子識別方法。此外,MPT程序中,粒子匹配結(jié)果的正確性一直是大家關(guān)心卻不能妥善解決的問題。一種辦法是使用數(shù)值算法生成模擬粒子運動軌跡和圖像序列,然后用實驗程序追蹤模擬粒子圖像,并與已知的粒子運動軌跡進行比較[4]。但是對模擬粒子圖像的追蹤效果并不能完全代表對真實圖像的處理,而且該方法并不能直觀地標記追蹤中發(fā)生錯誤的位置和錯誤的原因,不利于針對錯誤原因改進算法。

因此,通過測量直徑200nm的熒光粒子在純水中的布朗運動,在開發(fā)粒子追蹤程序中研究納米粒子光斑識別和匹配效果的可視化技術(shù)。通過調(diào)整灰度閾值比較粒子光斑面積變化進行“偽粒子”剔除。為了比較手動與程序追蹤的粒子匹配效果,提出矢量判別法顯示粒子匹配效果。通過測量φ 200nm粒子擴散系數(shù)驗證粒子追蹤法的有效性。

1 實驗與圖像處理方法

實驗在中物院力學所 LNM室進行。采用O-lympus IX71倒置熒光顯微鏡,配有NA=1.35的100倍油鏡進行觀測。圖像采集使用Andor iXon885 EMCCD,在bing 2模式下為501×502像素,像素尺寸為160nm/像素。實驗用粒子為200nm直徑的聚苯乙烯熒光粒子(Duke Scientific),熒光的吸收和發(fā)射波長分別為532nm和615nm。實驗時,熒光粒子在超純水中稀釋至體積分數(shù)約為10-5。

實驗溶液配置后的5～10min內(nèi)開始實驗。將約50μ L含納米熒光粒子的溶液滴到蓋玻片上,如圖1,液滴的直徑約3mm。CCD焦平面調(diào)至距離玻片上表面約10μ m。圖像采集時連續(xù)兩幀的時間間隔Δ t為36.5ms,其中包括圖像曝光時間約10ms和圖像傳輸時間。在同一位置連續(xù)拍攝200幀圖像。用4個液滴重復上述實驗,每次實驗持續(xù)時間為20～25min。實驗溫度在20～23℃±0.1℃,單次實驗過程中溫度變化小于±0.3℃。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic of the experimental setup

用手動追蹤和MPT程序追蹤分別進行圖像處理。手動追蹤是指人工進行粒子定位和匹配。對連續(xù)兩幀圖像進行粒子配對后得到多個粒子的單步位移Δx,然后對連續(xù)200幀圖像進行同樣的處理,獲得多個粒子的連續(xù)位移。根據(jù)Einstein公式,單個粒子運動的二維均方位移為

其中Δx為間隔時間Δt內(nèi)粒子的單步位移。對多個粒子的均方位移采用系綜平均計算,得到實驗擴散系數(shù)Dexp為

2 實驗結(jié)果

2.1 粒子識別的錯點剔除技術(shù)

對點光源進行成像時,由于散射和鏡頭球差的存在,成像光斑為一個圓斑和一個同心圓環(huán)的光暈。偏離焦平面中央的熒光納米粒子光斑外有明顯的光暈。MPT方法處理時,首先設(shè)定灰度閾值將圖像轉(zhuǎn)換為二值化圖像。部分帶光暈的光斑經(jīng)過二值化轉(zhuǎn)換后,光暈被離散成多個片段,如圖2(a)。在粒子識別時,這些光暈片段被當作粒子光斑,形成“偽粒子”。由于納米粒子成像時,本身光斑直徑較小,亮度較低,使用現(xiàn)有的基于光斑形態(tài)和灰度大小的算法很難有效剔除這類“偽粒子”。

我們發(fā)現(xiàn),假設(shè)在圖像二值化時所使用的灰度閾值改變量為 Δ G,粒子光斑和光暈的面積都有變化,但粒子光暈片段在低灰度閾值下相互連通,導致其面積變化Δ Sc比粒子光斑的面積變化Δ Sp更明顯。圖2(b)顯示,當 ΔG變化3%后,ΔSp≈20像素,而 ΔSc≈200像素。利用這一現(xiàn)象,在二值化過程中調(diào)整灰度閾值并檢測光斑面積變化,就可以有效地剔除“偽粒子”。

圖2 圖像二值化中不同灰度閾值時粒子光斑與光暈的面積變化Fig.2 The area varieties of one particle spot and its diffraction rings under different grayscale thresholds

2.2 粒子匹配的矢量判別法

對實驗拍攝的圖像分別采用手動追蹤和程序追蹤。將相鄰兩幀圖像中粒子匹配的結(jié)果以箭頭形式繪制,其中箭頭的起點為粒子起始位置,箭頭的大小和方向代表該粒子在Δ t時間內(nèi)的單步位移,如圖3。布朗運動是隨機的,因此矢量的方向任意,但矢量的大小可由已知粒子直徑代入Einstein-Stokes公式進行估計,因此矢量大小直觀地顯示了可能發(fā)生錯誤匹配的位置。假設(shè)手動追蹤的矢量場可靠,程序追蹤與手動追蹤矢量圖的夾角也提示用軟件進行粒子匹配可能發(fā)生錯誤,從而為改進MPT算法提供依據(jù)。根據(jù)公式(1),φ 200nm粒子的平均位移大小為4～5像素,而通常引起偽粒子識別的光暈距離粒子光斑中心為5像素以上,因此MPT程序的偽粒子識別將引起矢量夾角大于60°。當調(diào)整程序追蹤中使用的灰度閾值到2%后,所得到的矢量與手動追蹤的矢量圖基本相同,有一對錯誤,如圖3(a),圖中較小的矢量夾角是由于手動和程序追蹤使用了不同亞像素算法引起的。此外,粒子識別時的灰度閾值高低影響被追蹤的粒子個數(shù)。高閾值(如5%),圖3(b)未發(fā)現(xiàn)程序匹配錯誤,但部分粒子沒有被程序識別。此結(jié)果也說明矢量法還可以直觀判斷圖像識別時選擇的閾值的效果。正是分析圖3(a)中的錯誤匹配的粒子光斑,才發(fā)現(xiàn)了由于光暈引起的“偽粒子”問題。

2.3 錯點剔除算法驗證

圖3 粒子匹配手動追蹤(綠色)和程序追蹤(紅色)的粒子矢量位移比較Fig.3 Displacement vercors of the track results by MPT program(red)and by hand(green)

圖4 手動追蹤和程序追蹤給出的φ 200nm粒子實驗擴散系數(shù)測量結(jié)果的比較(橫坐標為實驗日期)Fig.4 The experimental diffusion coefficients of 200nm particles measured with MPT and by hand

為了驗證2.1節(jié)提出的光斑錯點剔除法和2.2節(jié)的粒子匹配矢量法,我們對φ 200nm粒子進行擴散系數(shù)測量實驗。圖像處理分別使用手動追蹤和程序追蹤,然后利用公式(2)計算實驗擴散系數(shù)。對4次實驗,程序中不含有錯點剔除算法時,追蹤結(jié)果與手動追蹤相比偏差很大約為8%～13%,如圖4(a);程序包含錯點剔除算法后的實驗擴散系數(shù)基本與手動追蹤的結(jié)果相同,如圖4(b),4次試驗中的3次中二者偏差不到2%,另外一次的偏差也降低為8%。

由于實驗拍攝的粒子圖像并不完全相同,因此每批實驗圖像應(yīng)該先選取一些使用手動追蹤。然后用MPT程序處理與手動結(jié)果比較,對灰度閾值進行選擇使二者結(jié)果一致,再用程序代替手動追蹤。

3 結(jié) 論

采用MPT方法測量200nm直徑的粒子在純水中的擴散系數(shù),在手動追蹤粒子位移的同時自主開發(fā)了程序,發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有MPT方法缺乏對粒子匹配效果的直觀顯示,影響對匹配算法的改進,而且納米粒子光暈會影響粒子識別,因此提出下述改進技術(shù)：

(1)在粒子識別過程中,調(diào)節(jié)灰度閾值并檢測粒子光斑面積變化,基于光斑及光暈的面積對閾值的敏感性可以有效地剔除光暈類“偽粒子”;

(2)在粒子匹配過程中,將連續(xù)兩幀中粒子位移用矢量表示,可以直觀顯示MPT方法中粒子匹配效果。

φ 200nm粒子擴散系數(shù)測量的實驗表明,在MPT方法中增加上述粒子識別法手動追蹤和程序追蹤獲得的實驗擴散系數(shù)的偏差由8%～13%減小為2%～8%,這表明使用基于光斑面積閾值敏感性的算法來剔除光暈引起的“偽粒子”是合理、有效的。

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