勵建榮，宣 偉，李學鵬，熊春華，王錫昌

(1.浙江省食品安全重點實驗室，浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310035；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

金屬硫蛋白的研究進展

勵建榮1，宣 偉1，李學鵬1，熊春華1，王錫昌2

(1.浙江省食品安全重點實驗室，浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310035；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

金屬硫蛋白(MT)具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度以及對重金屬的解毒作用，對激素的調(diào)節(jié)，細胞代謝的調(diào)節(jié)，細胞分化和增殖的控制以及參與紫外(UV)誘導反應和清除自由基都有重要作用。本文就金屬硫蛋白的性質(zhì)、生理功能、提取純化技術(shù)、檢測技術(shù)等研究進展及應用前景進行綜述，以期為其開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

金屬硫蛋白；理化性質(zhì)；生理功能；重金屬

Abstract：Metallothionein (MT) is a cysteine-rich, highly conserved, low molecular and heavy metal-binding protein, which plays important roles in modulating concentrations of trace elements and detoxification of heavy metals. In addition, MT is also involved in the regulation of hormonal and cell metabolism, the control of cell differentiation and proliferation, UV reaction and the scavenging of free radicals. In this paper, current research progress in the properties, physiological functions, extraction and purification technologies and detection strategies of MT have been reviewed and application prospects have been proposed,which will provide theoretical references and a basis for its future development and applications.

Key words：metallothionein；physico-chemical characteristics；physiological function；heavy metal

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)，化學名為金屬硫組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一類廣泛存在于生物中的低分子質(zhì)量(2～7kD)、富含半胱氨酸(20%～30%)、不含組氨酸和芳香族氨基酸的一類金屬結(jié)合蛋白質(zhì)。MT能被金屬、細胞因子、荷爾蒙、細胞毒性藥物、有機化學藥物和應激等誘導[1]。自1957年Margoshoes等[2]首次報道從馬腎中分離得到Cd-MT以來，MT成為基礎(chǔ)和應用科學的熱點之一，也是我國“863”重大攻關(guān)課題和“火炬”計劃之一，我國在MT的研究和應用方面已經(jīng)在國際上占有重要一席[3]。但目前，人們對金屬硫蛋白在生物學上的功能的認識遠遠不夠，還有待進一步研究。臨床實驗證明，MT具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度以及對重金屬的解毒作用，此外它對激素、細胞代謝的調(diào)節(jié)，細胞分化和增殖的控制以及參與紫外(UV)誘導反應和清除自由基都有重要作用。對MT的研究和開發(fā)利用涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、保健、生物工程、環(huán)境保護等各個領(lǐng)域[4]。到目前為止，已經(jīng)在瑞士、日本、美國、中國等國家相繼召開了5次金屬硫蛋白國際會議。本文就金屬硫蛋白的性質(zhì)、生理功能、提取純化技術(shù)、檢測技術(shù)等研究進展及應用前景進行綜述，以期為其開發(fā)應用提供參考。

1 金屬硫蛋白的理化性質(zhì)

目前，幾乎可以從所有的生物中提取純化出MT。研究發(fā)現(xiàn)，MT進化具有高度保守性，有MT-I、MT-II、MT-III及MT-IV四種異構(gòu)體，其中，MT-I和MT-II在大多數(shù)哺乳動物的內(nèi)臟器官中廣泛存在，尤以肝、腎細胞為主，而且參加其功能調(diào)節(jié)；MT-III分布主要限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布于星形膠質(zhì)細胞(集中于細胞體和突起中)，其次為神經(jīng)元細胞，也有報道稱少量分布于生殖細胞、小腸、胃、腎和嗅覺皮質(zhì)細胞中；MT-IV主要分布于皮膚、舌、消化道等器官的角質(zhì)細胞和復層鱗狀上皮細胞中[5-6]。Cys-X-Cys(X為除Cys以外的其他氨基酸)三肽序列是所有MT的特征序列，數(shù)量為7個[7]。MT的分子質(zhì)量在2～7kD，比一般的蛋白質(zhì)要低，等電點PI一般在4左右，如哺乳動物的PI在3.9～4.6之間，已發(fā)現(xiàn)的水生生物MT的PI在3.5～6.0之間。MT分子中不含芳香族氨基酸，所以它在波長280nm處無一般蛋白質(zhì)具有的吸收峰。結(jié)合不同金屬的MT的光吸收峰不同，如Zn-MT為220nm，Cd-MT為250nm，Cu-MT為275nm，Hg-MT為300nm[8]。

MT一般有兩個獨立的結(jié)構(gòu)域，氨基末端前30個氨基酸殘基為β結(jié)構(gòu)域，羧基末端30個氨基酸為α結(jié)構(gòu)域，29～31位氨基酸組成的中間區(qū)連接在一起，整個分子呈啞鈴狀。這種結(jié)構(gòu)使MT具有很好的熱穩(wěn)定性，其α域可結(jié)合4個二價金屬離子，β域可結(jié)合3個二價金屬離子[9]，Zhou等[10]研究發(fā)現(xiàn)β域二聚物對金屬的結(jié)合能力大于單個β域。低等的甲殼類無α域，如龍蝦的MT只含有兩個β域[11]。其結(jié)合金屬能力的順序為Hg2+＞Ag+＞Cu2+＞Cd2+＞Zn+，其一旦與Cd2+或者Ag+結(jié)合后，Cd2+和Ag+很難被其他金屬置換下來[12-13]，但是其上的金屬仍然可以脫去。使金屬硫蛋白上的金屬離子發(fā)生50%解離的pH值分別為：Zn-MT為3.5～4.5、Cd-MT為2.5～3.5、Cu-MT小于1[14]。MT亦容易受金屬誘導，其金屬誘導的能力順序為：Cd＞Zn＞Cu＞Hg[15]，但是Cd-MT對生物體有更大的毒性，所以在誘導MT時應選Zn為最佳，也有人利用非金屬Se誘導MT，發(fā)現(xiàn)其效果遠遠大于Cd[16-17]。由于金屬污染可誘導MT的合成，所以其被廣泛的用作水生生物體內(nèi)金屬暴露的生物標記[18]。

2 MT的主要生理功能

2.1 重金屬的去除解毒功能

關(guān)于MT對重金屬的解毒作用已經(jīng)有很多報道。如由Cd誘導的在睪丸中產(chǎn)生的MT可以抵抗Cd對其組織的損傷[19]，辛楠等[20]研究發(fā)現(xiàn)MT對于血鉛質(zhì)量濃度大于70μg/L的不育男性的精子密度和活率有著不同程度的改善(P＜0.05)。而Amiard等[21]發(fā)現(xiàn)貽貝體內(nèi)的金屬硫蛋白濃度隨著Pb2+的濃度增加而增加，金屬硫蛋白有很高的螯合金屬的能力，這可減輕Pb2+的損傷。Shao等[22]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過a-KKS-a(金屬硫蛋白突變基因)改造的項圈藻對重金屬有著很強的抵抗能力。目前，金屬硫蛋白解毒機理尚不明確，可能通過這樣3個途徑：1)與重金屬螯合成無活性的復合物；2)螯合重金屬，并將其排出體外[23]；3)減少金屬的進入量。目前普遍讓人接受的一種觀點是還原條件下MT通過巰基與金屬離子結(jié)合再形成Cys-M或Cys-M-Cys鍵。在氧化條件下，MT中Cys-M(M代表金屬離子)鍵斷裂使得金屬釋放出來并同時形成Cys-Cys鍵從而實現(xiàn)金屬的去除。Park等[24]通過研究敲除MT基因的小鼠發(fā)現(xiàn)，MT對一些重金屬的解毒能力的順序為Cd＞Zn＞Cu＞Ag，而對Pb和Fe幾乎無作用。MT的一個優(yōu)點就是它和其他蛋白不同，可抗酶解，不會被酶水解成單個的氨基酸，其能夠在胃腸道內(nèi)以完整的形式被吸收[25]。

2.2 自由基的清除功能

正常情況下，參與代謝的氧大多數(shù)與氫結(jié)合生成水，然而有一部分氧被酶催化形成超氧陰離子，后者又可以形成氧化氫，它們都屬于自由基。自由基有很多種，如氧自由基和羥自由基。一般來說，動物體組織內(nèi)自由基較少，其參與體內(nèi)的重要有益的反應。但當機體處于病理或應激時，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多，就使機體許多重要的生物大分子發(fā)生不可逆的氧化損傷，從而導致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞甚至導致細胞的突變[26]。由于MT具有特殊的化學結(jié)構(gòu)，其中的金屬具有動力學不穩(wěn)定性，巰基具有親核性傾向，使得MT易與某些親電性物質(zhì)，特別是與某些自由基相互作用[27]。Apostolova等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在成肌細胞向肌管分化的早期，Zn和MT瞬時分布在細胞核內(nèi)，分化過后MT表達下降，Zn和MT分布于細胞質(zhì)中，他們證明了MT在分化早期核中分布具有保護細胞免受自由基損傷的作用。MT清除羥自由基的能力是SOD的10000倍，而清除氧自由基的能力約是谷胱甘肽(GSH)的25倍，并且具有很強的抗氧化活性，在體內(nèi)可以作為補體抗氧化劑[29]。李連平等[30]利用鋅誘導普通海洋小球藻產(chǎn)生的Zn-MT-like對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基都具有很強的清除能力。

2.3 抗腫瘤功能

目前，關(guān)于MT抗腫瘤已經(jīng)引起了人們的注意，然其機制尚有待進一步明確，有人推測其能抗腫瘤可能是由于其能增強機體對不良環(huán)境的適應和去除重金屬、自由基等對機體的刺激。研究發(fā)現(xiàn)，乳突和卵泡甲狀腺腫瘤細胞中的MT-I+II基因與正常細胞相比，其表達下降，而后通過基因轉(zhuǎn)染使MT-I+II表達恢復可抑制惡性細胞的生長速度和腫瘤的發(fā)生[31]，Tashiro-Itoh等[32]的研究結(jié)果顯示，MT表達高低與腫瘤組織的分化有一定關(guān)系，MT表達量越高，腫瘤組織的分化越低，正面說明了MT有抗腫瘤作用。近年來，MT與某些抗腫瘤藥物間的相互作用已成為研究重點，深入研究MT與腫瘤的關(guān)系可望獲得治療腫瘤的有效藥物。然而，亦有一些研究支持MT促進腫瘤細胞的生長的說法，其實是通過兩種機制：1)MT可以向各種轉(zhuǎn)錄因子提供Zn，包括腫瘤抑制基因產(chǎn)物如P53，體外實驗證明硫蛋白可以調(diào)節(jié)激活SP1的轉(zhuǎn)錄[33]；2) MT能抑制細胞死亡[34]，因此可作為抗腫瘤藥物。李天等[35]的研究發(fā)現(xiàn)MT對宮頸癌細胞有濃度依賴性的促進增值作用，在質(zhì)量濃度為1ng/mL、作用時間為24h時效應最為明顯；此外，MT刺激可使宮頸癌細胞PCNA蛋白表達水平增高，表明MT參與宮頸癌細胞的增殖。因此關(guān)于MT與腫瘤之間的關(guān)系還有待于進一步研究。

3 MT的提取及分離純化技術(shù)

MT的提取及分離純化已有很多介紹，然而其分離純化方法仍有待進一步提高。MT的分離純化與Nostelbacher等采用的方法大抵相同，都是將凝膠過濾和離子交換技術(shù)相結(jié)合的層析法，將獲得的凍干樣品溶解于三蒸餾水中，－80℃保存。只是MT的粗制品提取方面有點差異，有人利用金屬硫蛋白的熱穩(wěn)定性，在第一步變性除去雜蛋白后，采用75℃熱變性3～5min除雜蛋白的方法制得MT粗制品[37]，然而這種方法有一定的欠缺，加熱的時間不太明確，且加熱后仍然有大量的雜蛋白，從而影響MT的純度，為后續(xù)的分離純化帶來不便[38]。

4 MT的檢測技術(shù)

對于MT的檢測技術(shù)有不少報道，這些技術(shù)都是建立在MT的理化特性和生物特性以及免疫學特性基礎(chǔ)上的，主要有以下幾種：

4.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法(RIA)就是利用放射性核素標記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復合物的原理來進行分析的一種方法。RIA法首先由vander Mallie等[39]于1979年檢測大鼠血清中MT的含量時建立, Mulder等[40]建立了測定人體液MT含量的RIA。此方法的檢測范圍在0.1～100ng/mL之間。

該方法具有高度特異性的優(yōu)點，但是該法由于使用放射性同位素，具有放射性污染，且在測量時需要昂貴專用儀器，測定成本較高。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是以抗原與抗體的特異性反應為基礎(chǔ)，加上酶與底物的特異性反應，使反應的靈敏度放大的一種技術(shù)。它可以對抗原或者抗體進行定性，也可以通過酶與底物的反應產(chǎn)生顏色，借助吸光度來進行定量。Thoma-Uszynski等[41]在1986年建立了熒光ELISA，其靈敏度與RIA 相似，但ELISA 受血清蛋白的干擾，靈敏度會有所下降。

該方法離大幅度推廣應用還有一定的距離，然其特異性高，測定相對迅速，無需昂貴的儀器設(shè)備，避免接觸放射性同位素，具有能大幅度提高靈敏度的潛力等優(yōu)勢，是多數(shù)現(xiàn)采用MT的方法所不能比擬的。

4.3 金屬結(jié)合法[42]

有人利用血紅蛋白與Cd2+能穩(wěn)定結(jié)合的特性去除加入過量的109Cd，然后通過檢測樣品中與MT結(jié)合的Cd2+含量而對MT定量，該法的檢測下限為0.8μg MT/g組織，但不能用于Bi、Hg、Ag、Cu-MT樣品的測定。

4.4 色譜法[43]

利用HPLC法將Cd誘導大鼠的肝臟中的MT分離出來，直接聯(lián)于A AS后，檢測樣品中金屬含量，達到對MT定量檢測的目的，該方法可在1h內(nèi)檢出質(zhì)量濃度小于1μg/mL上柱樣品中的MT含量，并可分別測定不同型的MT。RP-HPLC最適于對MT同分異構(gòu)體的研究。此外，還可利用HPLC分離MT后，根據(jù)樣品對波長150nm紫外光吸收特性來直接對MT定量。

4.5 示差脈沖極譜法[44]

示差脈沖極譜法(OPP法)是利用巰基在汞滴電極表面產(chǎn)生氧化還原反應后，出現(xiàn)電位變化而測定MT。該法的檢測限為1.0×10-8mol/L，不受MT分子中金屬含量的影響，但受到其他種含巰基蛋白的干擾，故在測定前除雜蛋白。

4.6 共振光散射法

共振光散射光譜法是通過調(diào)節(jié)激發(fā)光波長和發(fā)射光波長相等，即可獲得待測組分所引起的共振光散射強度。共振光散射強度與共振光散射粒子的濃度在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系，據(jù)此可直接進行定量分析[45]。薛金花等[46]利用共振光散射光譜法在波長505nm處檢測了MT的含量，且檢出限為19.05ng/mL，該方法靈敏、簡便、選擇性好。

5 目前對MT的研究不足之處

對金屬硫蛋白的研究已經(jīng)近半個世紀，然對其的研究仍有不足之處，主要表現(xiàn)如下：1)MT的價格極其昂貴，在國內(nèi)其純度在70%以上價格為3000元/g，純度在95%以上價格為45000～50000元/g。且尚無有效的方法能大量生產(chǎn)MT，從而使其應用和研究受到限制；2)MT的分離純化方法有待進一步提高；3)影響組織和體液中MT的濃度因素還不明確，有待進一步研究[47]；4)MT與金屬牢牢的結(jié)合在一起，目前尚無有效的方法將其上的金屬離子完全洗脫下來，從而使其應用范圍受到限制；5)MT的檢測方法多種多樣，檢測效果不理想且標準不統(tǒng)一[48]；6)目前關(guān)于MT的報道研究只是涉及到其誘導、生理性質(zhì)等方面。然其毒理學方面的實驗鮮有報道，從而影響其進一步的應用；7)MT在各個生物體內(nèi)的半衰期不同，限制了其應用范圍[49]。

6 MT的應用前景

6.1 在水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工中的應用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以嘗試應用MT作為飼料添加劑，用作生長激素促進水生生物的生長繁殖，同樣也可以增強水生生物的免疫力和去除重金屬的能力[50]。在水產(chǎn)品加工過程中的應用方面，鑒于上述MT與重金屬的螯合功能，可嘗試著將MT固定在殼聚糖或者海藻酸鈉上制成均勻大小的微球顆粒用于文蛤、扇貝等水解液中重金屬的去除。

6.2 在工業(yè)中的應用

在食品工業(yè)方面，MT有望應用于營養(yǎng)保健品生產(chǎn)，可使食品具有多種保健功能，如兒童營養(yǎng)添加劑，若能成功開發(fā)并應用于食品中，必將受到市場的青睞，成為人們食品消費的新熱點。在化妝品業(yè)方面，由于MT與SOD相比具有分子質(zhì)量小、易為機體吸收、清除羥自由基能力強、熱穩(wěn)定性高、半衰期長等優(yōu)點，其有可能開發(fā)應用于化妝品中[51]。

6.3 在環(huán)境監(jiān)測方面的應用

由于MT在轉(zhuǎn)錄水平易被環(huán)境中的重金屬所誘導，且與濃度有相關(guān)性，可以反映環(huán)境中的重金屬含量。因此在環(huán)境監(jiān)測污染方面有著重大的應用前景[52]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)牡蠣中MT的含量可以作為檢驗海域污染情況的一種生物標記[53]。

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Research Progress in Metallothionein

LI Jian-rong1，XUAN Wei1，LI Xue-peng1，XIONG Chun-hua1，WANG Xi-chang2
(1. Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035, China；2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Q513

A

1002-6630(2010)17-0392-05

2010-01-18

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2008BAD94B09)

勵建榮(1964—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制、食品生物技術(shù)研究。E-mail：lijianrong@mail.zjgsu.edu.cn