李 穎,柴文戍,劉 硯,寧學(xué)聰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121001)

銅綠假單胞菌(PA)屬革蘭陰性條件致病菌,易感染燒傷或免疫力低下患者。研究證明,PA可通過(guò)依賴ATP、P2Z受體介導(dǎo)的細(xì)胞壞死或非依賴ATP、caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡[1],同時(shí)伴有Bax表達(dá)增加和 Bcl-2表達(dá)降低,細(xì)胞色素 C釋放增加以及 caspase3/9活化增加。因此推測(cè),PA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡與線粒體途徑有關(guān)。凋亡誘導(dǎo)因子 (A IF)是存在于線粒體膜間隙中的黃素蛋白[2],具有很強(qiáng)的促凋亡活性。本研究通過(guò)觀察 PA上清液誘導(dǎo)的 J774細(xì)胞凋亡以及 A IF在凋亡過(guò)程中的表達(dá),探討 PA感染宿主的發(fā)病機(jī)制,為臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 PA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC27853,遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心惠贈(zèng),用 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。J774巨噬細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。培養(yǎng)基采用含 10%FBS和 100 U/ml慶大霉素的高糖型DMEM。Annexin VFITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司,A IF抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌上清液制備 在 8 ml的大豆肉湯培養(yǎng)基中采用振顫法(37℃,8 h)對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng),離心15 min,過(guò)濾,獲得細(xì)菌上清液,56℃滅活 1 h,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌上清液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 將貼壁的 J774細(xì)胞常規(guī)胰蛋白酶消化傳代,接種于培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔 2 d換液 1次。待生長(zhǎng)基本融合后,棄培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入 2 ml含胎牛血清、含細(xì)菌上清液、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基,對(duì)照組則加入 2 ml含胎牛血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基,37℃水浴中培養(yǎng) 3、6、9 h后分別進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.3 凋亡細(xì)胞檢測(cè) ①Gimsa染色:將培養(yǎng)后的細(xì)胞用 PBS沖洗,甲醇固定、干燥,G imsa染液染色15 min,沖洗,晾干,普通顯微鏡下觀察。②熒光染色計(jì)數(shù):將培養(yǎng)后的細(xì)胞用 Hoechst 33258染色,熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)。③Annexin-V FITC/PI雙染分析:待檢細(xì)胞用 Annexin-V FITC/PI雙染,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù) 1× 105個(gè)細(xì)胞。④Western blot法測(cè)定 A IF含量:將培養(yǎng)后的細(xì)胞用 PBS沖洗,加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白,離心收集上清,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每份樣品取 40μg進(jìn)行 12%SDS-PAGE分析,濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至 PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,加入一抗, 4℃振蕩過(guò)夜,加入羊抗兔 Ig M作用 2 h,采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS16.0軟件,計(jì)量資料以表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩組比較采用 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gimsa染色 3 h組細(xì)胞膜完整,但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象;6 h組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài);9 h組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓,可見凋亡小體。隨時(shí)間延長(zhǎng),各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞逐漸增多,對(duì)照組細(xì)胞則正常生長(zhǎng)。

2.2 熒光染色 3 h組有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡,隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,6、9 h組細(xì)胞皺縮,核密度增高,核斷裂,可見凋亡小體,細(xì)胞染色質(zhì)呈濃染的塊狀或顆粒狀熒光,聚集于核周邊或裂解成碎片。

2.3 Annexin-V FITC/PI雙染分析 實(shí)驗(yàn) 3、6、9 h組的細(xì)胞凋亡率分別為 (15.76±1.13)%、(36.02 ±0.95)%、(55.45±2.42)%,對(duì)照組為 (2.68± 0.45)%。表明 PA上清液可誘導(dǎo) J774細(xì)胞迅速發(fā)生凋亡,且凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯升高,組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＜0.01)。

2.4 Western blot法測(cè)定 A IF含量 實(shí)驗(yàn) 3、6、9 h組A IF蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為 0.39±0.013、0.59 ±0.023、0.72±0.020,對(duì)照組為 0.26±0.017。3 h組A IF開始出現(xiàn)低量表達(dá),6、9 h組A IF表達(dá)更加明顯,與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＜0.01)。

3 討論

A IF具有氧化還原、電子傳遞和維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)功能,還含有線粒體定位信號(hào)和核定位信號(hào)序列,具有很強(qiáng)的促凋亡活性。然而,A IF是否參與了 PA上清液誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞J774細(xì)胞凋亡的過(guò)程目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PA上清液能誘導(dǎo)J774細(xì)胞發(fā)生凋亡,且隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞數(shù)量增多。提示 PA以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)人 J774細(xì)胞凋亡,與國(guó)外研究一致[3]。

線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器,也是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動(dòng)中心。凋亡誘導(dǎo)物誘導(dǎo)線粒體上的膜透過(guò)性轉(zhuǎn)變孔開放,導(dǎo)致多種凋亡蛋白,如細(xì)胞色素C、A IF、caspase前體蛋白等,從線粒體膜間隙被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,引起細(xì)胞凋亡[4,5],具有核定位信號(hào)序列的A IF被釋放至細(xì)胞質(zhì)后,便進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。據(jù)報(bào)道,光敏療法能引起細(xì)胞凋亡,通過(guò)細(xì)胞色素 C介導(dǎo)依賴 caspase和A IF介導(dǎo)非依賴 caspase兩種途徑,當(dāng)?shù)谝粋€(gè)途徑被阻止,則細(xì)胞凋亡依靠 A IF介導(dǎo)[6]。本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在 PA上清液培養(yǎng) J774細(xì)胞 3 h后 A IF開始出現(xiàn)低量表達(dá),繼續(xù)培養(yǎng) 6、9 h時(shí) A IF蛋白表達(dá)更加明顯。證明A IF蛋白與 PA上清液誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡的過(guò)程有關(guān)。國(guó)外研究認(rèn)為,A IF蛋白作為線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑,擁有氧化還原酶區(qū)域,能夠引起染色質(zhì)的初步凝集和DNA大規(guī)模斷片化,進(jìn)而引發(fā)不依賴于 caspase的細(xì)胞凋亡[7,8]。

終上所述,PA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡可能與線粒體有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明,活化的 JNK和 p38能阻止A IF進(jìn)入細(xì)胞核,從而阻止A IF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此尋找抑制線粒體途徑的藥物治療各種 PA相關(guān)性疾病有著良好的應(yīng)用前景。

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