劉慧敏,范凌云,張瑞英,張美蓮,馬軍格

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院,河北邯鄲 056029)

研究發(fā)現(xiàn)[1],Toll樣受體-9(TLR9)參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者體內(nèi)抗dsDNA抗體的產(chǎn)生,且可能是產(chǎn)生抗dsDNA抗體的重要機(jī)制之一。TLR9可被非微生物的內(nèi)源性配體活化[2]。2008年2月 ～2009年12月,我們?cè)跓o(wú)菌條件下取SLE患者外周血,模擬設(shè)計(jì)并人工合成含非甲基化磷酸胞苷酰(CpG)寡核苷酸片段,用于阻斷SLE患者外周血單一核細(xì)胞上的TLR9,觀察該片段能否使SLE患者機(jī)體減少甚至不產(chǎn)生致病性抗dsDNA抗體。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640、胎牛血清,小牛胸腺DNA(nCTDNA)、Protein Detector TMELISA試劑盒。

1.2 含非甲基化CpG寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)含非甲基化CpG的寡核苷酸片段(擬合成的寡核苷酸序列為Cp GODN(5′-TCCATCACGTTCCTGATGCT-3′),由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 人外周血單一核細(xì)胞(PBMC)的制備及培養(yǎng)無(wú)菌條件下取SLE患者(60例)外周血,肝素抗凝,淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml,于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及抗dsDNA抗體測(cè)定 A組為實(shí)驗(yàn)組：PBMC培養(yǎng)液中加入人工合成的寡核苷酸片段(按終濃度10 ng/ml),再用nCTDNA作為免疫原刺激PBMC;B組為陽(yáng)性對(duì)照組：用nCTDNA作為免疫原刺激PBMC;C組為陰性對(duì)照組：PBMC培養(yǎng)液中加入等量PBS,再用nCTDNA作為免疫原刺激PBMC。用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中抗dsDNA抗體,按文獻(xiàn)[3]的方法操作。每樣本重復(fù) 3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,資料比較用單因素方差分析和 χ2檢驗(yàn)。α=0.05。

2 結(jié)果

成功合成了含非甲基化CpG的寡核苷酸片段,并經(jīng)測(cè)序簽定為所需要的寡核苷酸片段。A、B、C組細(xì)胞上清液中抗dsDNA抗體濃度分別為1.21、0.24、0.08 pg/m l,A組明顯高于B組(P＜0.05),雖然也較C組升高,但P＞0.05。

3 討論

SLE的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能是由于一個(gè)具有遺傳素質(zhì)者,在環(huán)境因素或(和)性激素的影響下,觸發(fā)了機(jī)體異常免疫應(yīng)答,持續(xù)產(chǎn)生大量免疫復(fù)合物和致病性自身抗體,引起組織損傷和各種臨床癥狀[4]。其中,自身抗體產(chǎn)生在SLE的發(fā)病過程中起重要作用,并可引起多系統(tǒng)、器官功能損害等并發(fā)癥[5]。

研究發(fā)現(xiàn)[6],SLE模型和患者體內(nèi)均有多克隆B細(xì)胞的激活,后者產(chǎn)生大量自身抗體。主要表達(dá)在人B細(xì)胞上的TLR9是天然免疫受體TLR家族成員之一[7],它通過特異地識(shí)別含非甲基化CpG基因序列的細(xì)菌和病毒DNA及人工合成的寡核苷酸,激活機(jī)體的天然免疫,且也為獲得性免疫中免疫細(xì)胞的活化提供刺激信號(hào),在抗感染免疫和變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病中具有重要作用[8]。我們的前期研究結(jié)果表明[1],TLR9參與了SLE患者抗dsDNA抗體的產(chǎn)生,且TLR9介導(dǎo)的抗dsDNA抗體產(chǎn)生是經(jīng)由髓樣分化因子88(MyD88)依賴的MyD88/白介素受體相關(guān)激酶(IRAKs)/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)/NF-κB經(jīng)典路徑發(fā)生的。本研究中,我們模擬設(shè)計(jì)并合成了含非甲基化CpG的寡核苷酸片段,經(jīng)過生物學(xué)活性測(cè)定篩選出一條寡核苷酸多肽,能抑制抗dsDNA抗體產(chǎn)生,說明該人工合成的含非甲基化CpG寡核苷酸片段能與表達(dá)于PBMC上的TLR9競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,抑制抗dsDNA抗體的產(chǎn)生。

總之,我們成功合成并篩選出靶向含非甲基化CpG的寡核苷酸片段。但該寡核苷酸片段的安全性、毒性等有待進(jìn)一步觀察研究。

[1]劉慧敏,張瑞英,耿靜,等.Toll樣受體-9在SLE患者產(chǎn)生抗dsDNA抗體中的作用[J].中華皮膚科雜志,2007,40(1)：25-27.

[2]Marshak-Rothstein A,Busconi L,Lau CM,et al.Comparison of CpGs-ODNs,chromatin immune complexes,and dsDNA fragment immune complexes in the TLR-9-dependentactivation of rheumatoid factor B cells[J].JEndotoxin Res,2004,10(4)：247-251.

[3]李智銘,徐世正,林孝華,等.CpG序列在誘生抗dsDNA抗體中的作用[J].中華皮膚科雜志,2004,37(12)：687-689.

[4]劉嘉玲.系統(tǒng)性紅斑狼瘡與心血管病[J].中國(guó)臨床醫(yī)生, 2005,33(4)：14-16.

[5]曾曉鋒,劉堅(jiān),金濤,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡死亡的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及其死因和臨床病理分析[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志,2006, 4(17)：1548-1550.

[6]王玉璽,王麗,王俊志,等.祛毒膠囊對(duì)狼瘡樣小鼠外周血白細(xì)胞介素-6、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α的影響[J].中華現(xiàn)代皮膚科學(xué)雜志,2005,25(6)：193-194.

[7]章曉聯(lián),潘勤.Toll樣受體在免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,18(5)：670-672.

[8]BernasconiNL,Onai N,Lanzavecchia A.A role for Toll-like receptors in acquired immunity：up-regulation of TLR 9 by BCR triggering in naive B cells and constitutive expression in memory B cells[J]. Blood,2003,101(11)：4500-4504.