胡明明，張艷禾，王春來

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所、獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001）

副豬嗜血桿菌病又稱“革拉瑟氏病”，是由副豬嗜血桿菌(HPS)引起的一種以豬多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、呼吸困難、高熱及高死亡率為特征的傳染性疾病。隨著規(guī)模化、集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病由過去散發(fā)的傳染病變?yōu)榇竺娣e流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。我們將從近年來副豬嗜血桿菌病的病原學、流行病學、臨床癥狀與病理變化、分子生物學以及臨床診斷和防治等方面的研究進展，進而多方面清晰地認識、了解該疾病發(fā)病原因及其產(chǎn)生的危害，并以此為現(xiàn)實生產(chǎn)中副豬嗜血桿菌的治療和綜合防控提供借鑒意義，避免此病的流行和暴發(fā)。

一、病原特征

（一）形態(tài)學及生理生化特性1910年，德國科學家Glasser 首次描述了漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎以及腦膜炎患豬的漿液性分泌物中，存在一種革蘭氏陰性桿菌，但這種病原菌直到1922年才由Sehermer和Ehrlieh首次分離并鑒定。HPS屬于需氧或兼性厭氧菌革蘭氏陰性菌，非溶血性、不運動、生長需要特定的V因子(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)，最適生長溫度為35℃～37℃，pH7.6～7.8。在顯微鏡下呈多形態(tài)，新分離的菌株呈球桿狀、雙球狀或短鏈狀，在陳舊培養(yǎng)物中呈長桿狀和絲狀。HPS通常有莢膜，但體外培養(yǎng)時易受影響，可變?yōu)闊o莢膜菌。脲酶和氧化酶試驗陰性，接觸酶試驗陽性，可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖等。Morozumi 和Hiramune等研究了不同溫度條件下HPS在生理鹽水和PBS（磷酸鹽緩沖溶液）中的存活能力，當HPS存在于生理鹽水或PBS中42℃1 h、37℃2 h、25℃8 h，均檢測不到HPS活菌。由此看來，HPS生長條件要求苛刻并且分離困難，在外界環(huán)境中的死亡速度非?？欤虼藢υ摼囵B(yǎng)和保存的要求非常高，這給研究者帶來極大的困難。

（二）流行病學副豬嗜血桿菌是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道的一種常在菌，可在鼻腔、扁桃體和氣管前段分離到，而不見任何臨床癥狀。當環(huán)境發(fā)生變化時或引起免疫抑制的因素存在時，會侵入機體并引起嚴重的全身性疾病。本病的主要傳染源為病豬、臨床康復的豬和隱性感染豬；主要的傳播途徑為呼吸道和消化道，即病菌通過飛沫隨呼吸運動而進入健康的仔豬體內(nèi)，或通過污染飼料和飲水而經(jīng)消化道侵入體內(nèi)，在機體抗病力降低的情況下，繁殖、產(chǎn)毒和致病。HPS有很強的宿主特異性，只感染豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病，感染高峰通常見于保育期的4～6周，發(fā)病率可達40%，嚴重時死亡率可達50%。

HPS常與豬的幾種重要病原體如豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環(huán)病毒引起混合感染。周小兵等(2006)研究結(jié)果表明，保育舍內(nèi)流行豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環(huán)病毒時，副豬嗜血桿菌導致的死亡率會增高，即豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環(huán)病毒的感染會破壞肺泡巨噬細胞，還會引起鼻腔黏膜炎癥,從而破壞非特異性呼吸道防御機制，因而使豬容易發(fā)生繼發(fā)性感染。HPS一年四季均可發(fā)病，但有研究表明冬季HPS的感染率和致死率都遠遠大于夏季，這是由于冬季寒冷的氣候?qū)γ庖呦到y(tǒng)影響較大，致使豬只對HPS的抵抗力降低。另有報道，本病的發(fā)生常與長途運輸、疲勞和其他應激因素等誘因有關。

二、分子生物學

（一）分型雖然研究HPS病原菌流行病學對于該疾病的防治具有重要意義，但是HPS病原菌通常有較多種系遺傳變異，因此對病原菌的鑒定和分型就變得更為迫切，因此精確確定其流行病學的特征，可為疾病的診斷和防治提供準確的理論依據(jù)。目前，HPS分型方法包括血清型和基因型。

副豬嗜血桿菌的血清型復雜多樣，按瓊脂擴散血清分型方法(KRG)，可將副豬嗜血桿菌分為1～15個血清型（國際公認的血清分型標準菌株）。在全世界范圍內(nèi)，各國流行的血清型不盡相同，我國分離株主要是血清4、5、12、13型，在日本和澳大利亞廣泛流行的血清型為5型，而危害美國豬場的HPS血清型為4型。在鑒定的15個血清型中毒力存在明顯的差別，血清型1、5、10、12、13、14型毒力最強，患豬在4 d內(nèi)歸于死亡或處于瀕死狀態(tài)；血清2、4、15型為中等毒力，患豬通常不死亡但出現(xiàn)多發(fā)性漿膜炎；血清 3、6、7、8、9、11型感染豬后沒有明顯的臨床癥狀，這些菌株歸類為無毒力菌株。另有20%以上的分離株血清型不可定。這可能是由于一些分離株不能表達足夠多的特異性，或者可能還存在另外的一些血清型。

基因分型方法克服了血清學分型的局限性，且靈敏度高，操作簡單，為HPS流行病學研究、菌株鑒定，以及了解散發(fā)及流行規(guī)律、致病機制等方面提供了有力的研究手段。基因分型包括MEE，REF，ERIC等技術。Blackall等1997年用多位點酶電泳(MEE)研究了40個澳大利亞HPS分離株及8個血清型的過氧化氫酶等17種酶的電泳圖譜，獲得了34種電泳型，經(jīng)聚類分析，除一個分離株的過氧化氫酶電泳酶譜呈現(xiàn)單一條帶外(代表了一個種或亞種)，其余的33種電泳酶譜聚類為兩組：第一組包括40個分離株中的血清型4、5 型、部分13型、2個不能分型的菌株，以及2個血清5型的標準菌株；第二組中的血清型范圍較廣，包括40個菌株中的血清1、2、7、9、10 型和部分13型，以及標準株的1、2、3、4、8、9型。結(jié)果表明HPS 的遺傳差異性很大，菌群中不止一個種或亞種，而且同一血清型菌株的電泳酶譜不定相同(如血清13 型分離株)。該研究證實了不同的HPS之間存在著多態(tài)性。Smart等運用限制性核酸內(nèi)切酶指紋(REF)技術研究HPS在SPF豬和常規(guī)飼養(yǎng)豬的流行與分布，發(fā)現(xiàn)大多SPF豬帶有相同REF的HPS，而常規(guī)飼養(yǎng)豬帶菌的REF則存在很大差異，僅有一個菌株為所有試驗豬共有。在感染了地方性動物傳染病的豬群中，患病豬系統(tǒng)組織的HPS分離株的REF指紋相似性程度很高，這些研究結(jié)果顯示REF可以作為一種非常有效的分型手段。重復序列PCR（rep-PCR）也是一種研究流行病學的有效手段，Rafiee等2000年用腸桿菌科基因間重復一致序列（ERIC）-PCR技術研究了HPS的15種血清型，澳大利亞的14個分離株：3個突發(fā)HPS傳染病豬群的12個分離株以及2個其他豬場分離株的ERIC—PCR指紋。結(jié)果顯示：15種血清型均呈現(xiàn)了唯一獨特的ERIC-PCR指紋，且重復性高；3個突發(fā)HPS傳染病豬群的12個分離株擁有共同的ERICPCR指紋，并且明顯不同于15種血清型和來自其他豬場的2個分離株的ERIC-PCR指紋，表明3個豬場HPS病的暴發(fā)來自同一病原菌在比較和描述菌株特性方面，較血清學方法更有效。

（二）致病機理及毒力因子副豬嗜血桿菌感染后侵入全身的機理還不清楚。Miniats研究表明，免疫動物的抗體主要針對外膜蛋白（OMP），OMP有很強的免疫原性。Ruiz等2001年通過分析從健康仔豬與患病豬分離的HPS OMP也表明外膜蛋白與HPS的毒力有確切關系。但OMP是否是主要的免疫原尚需進一步研究。另外，神經(jīng)氨酸酶是巴斯德菌科細菌的一種潛在毒力因子，該酶可通過清除宿主細胞的碳水化合物，從而發(fā)揮細菌毒力。除了對營養(yǎng)方面的影響以外，神經(jīng)氨酸酶還介導清除與宿主細胞糖原結(jié)合的唾液酸，從而暴露出細菌定居或侵入宿主細胞所需的受體，并通過降低粘蛋白的粘性來干擾宿主的防御系統(tǒng)。Lichtensteiger 等(1997)研究結(jié)果顯示，90%以上的田間分離株有神經(jīng)氨酸酶，由此推斷神經(jīng)氨酸酶也可能為HPS的一個毒力因子。鐵是細菌生長不可缺少的元素，但是由于宿主糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白的絡合作用，細菌外環(huán)境的鐵含量很少。Charlnad等(1995)的研究結(jié)果證明，豬血清中存在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，HPS利用自身的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白（tbp）提供生長必需的鐵離子，推斷tbp在HPS感染宿主動物引起發(fā)病過程中起重要作用。還有研究表明Fhu蛋白也是體液免疫反應的目標之一，且表達水平并不受鐵的供應情況的限制，由此推斷Fhu蛋白也是副豬嗜血桿菌的毒力因子之一。這些研究結(jié)果拓展了研究者對HPS病原本質(zhì)更深入的認識，為今后該疾病的診斷和藥物治療新靶點開發(fā)新型疫苗提供了可能性。

三、臨床癥狀及病理變化

（一）臨床癥狀2～8周齡仔豬感染發(fā)病可呈典型癥狀，育肥豬感染多見慢性經(jīng)過，哺乳母豬也可感染發(fā)病。在臨床上常見以下兩種病癥：急性型：許多豬只突然同時發(fā)病，往往首先發(fā)生于膘情良好的豬，體溫40.5℃～42℃，食欲下降或不食，并伴有咳嗽、呼吸困難等癥狀。鼻孔有粘液性及漿液性分泌物。關節(jié)腫脹、跛行、步態(tài)僵硬，同時出現(xiàn)身體顫抖，共濟失調(diào)，可視黏膜發(fā)紺，在1～4 d內(nèi)死亡。個別豬只不表現(xiàn)任何癥狀而突然死亡，也有的轉(zhuǎn)化為亞急性或慢性型。亞急性型和慢性型：常由急性型轉(zhuǎn)化而來，病豬表現(xiàn)被毛粗亂，反復發(fā)熱，咳嗽、呼吸困難、耳邊緣發(fā)紫。有的腹下和四肢末梢等皮膚有紫紅色斑塊，體表發(fā)紺，常見眼瞼、耳翼浮腫，跛行和呈犬坐姿勢或不愛運動。

（二）剖檢變化剖檢特征主要表現(xiàn)為漿液性、纖維素性、多發(fā)性漿膜炎和多發(fā)性關節(jié)炎，胸腔內(nèi)有大量的淡紅色液體及纖維素性滲出物凝塊。肺表面覆蓋有大量的纖維素性滲出物并與胸壁粘連，多數(shù)為間質(zhì)性肺炎，部分有對稱性肉樣變化，肺水腫、腹膜炎，常表現(xiàn)為化膿性或纖維性腹膜炎，腹腔積液或與內(nèi)臟器官粘連；心包炎、心包積液，心包內(nèi)常有奶酪樣甚至豆腐渣樣滲出物，使外膜與心臟粘連在一起，形成“絨毛心”，心肌有出血點；全身淋巴結(jié)腫大，呈暗紅色，切面呈大理石樣花紋；脾臟腫大，有出血性梗死；關節(jié)腫大，關節(jié)腔有漿液性滲出性炎癥。

（三）病理組織學觀察氣管以及肺支氣管可觀察到的黏膜上皮脫落，黏膜下水腫伴有出血, 中性粒細胞浸潤，同樣的病變也可在小腸和大腸中觀察到。另外，在小腸中還有大量的酸性粒細胞浸潤；在心臟、脾臟以及大腦中也可發(fā)現(xiàn)有中性粒細胞浸潤；在心臟中還可觀察到部分心肌纖維斷裂，有的心肌細胞發(fā)生顆粒變性或水泡變性。肝臟呈灶狀壞死，有的肝細胞腫大，灶狀壞死同樣見于大腦和腎臟中，在大腦中壞死灶周圍的神經(jīng)原細胞嚴重腫脹，膠質(zhì)細胞增生，出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)原現(xiàn)象。

四、診斷與防治

（一）診斷通過病史調(diào)查、流行病學、臨床癥狀及剖檢變化等可做出初步診斷，確診還需要進一步實驗室檢驗。首先，采取病死豬的肺、心血、肝、腎、淋巴結(jié)及腹水、胸水等病料進行分離、培養(yǎng)、鑒定病原。本菌不發(fā)生溶血現(xiàn)象，并進一步進行生化鑒定，本菌可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麥芽糖，對葡萄糖發(fā)酵不穩(wěn)定；醋酸鉛試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗呈陽性。通過血清學診斷方法，如瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗和間接血凝試驗，具有反應靈敏、方便快捷的特點，適合于臨床應用。血清學檢測可作為豬群感染與否的診斷，但不能確診豬群是否發(fā)病。因為多數(shù)豬群中都具有抗副豬嗜血桿菌的抗體，但抗體滴度較低，均不表現(xiàn)臨床癥狀。此病確診還需借助聚合酶鏈式反應(PCR)，該技術可大大提高副豬嗜血桿菌感染診斷的靈敏性。Blackall用多點酶電泳(MEE)、Smart用內(nèi)切酶指紋法、Rafiee和Ruiz用PCR法對本菌基因分型，其結(jié)果顯示該方法對所有的菌株都能作出鑒定。因副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的一種常在菌，常在健康豬的上呼吸道可分離出該菌。臨床癥狀又與豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜肺炎、豬丹毒、豬肺疫、仔豬副傷寒及氣喘病等相似，且易與這些疫病混合感染和繼發(fā)感染。故確診該病要綜合運用上述診斷方法。

（二）預防副豬嗜血桿菌病的綜合預防方案包括免疫接種、藥物預防和加強飼養(yǎng)管理。

1.免疫接種。疫苗的使用是預防副豬嗜血桿菌造成損失的最為有效的方法之一，商品苗和自家苗可以防制副豬嗜血桿菌傳染病。然而多種血清型和一定量非分型菌株的存在,影響了滅活疫苗有效的交叉保護。Miniats等(1991)以兩株高毒力副豬嗜血桿菌所制備的菌苗誘發(fā)了可以抵抗同源和異源攻擊的交叉保護。相反地，低毒力菌株的菌苗只能抵抗同源攻擊。因此推斷細菌的毒力可能與其免疫保護力呈正相關，但使用活性強毒菌株存在安全等問題。

目前，哈爾濱獸醫(yī)研究所，正在對HPS滅活疫苗進行研究，對免疫后母豬生產(chǎn)的仔豬ELISA檢測結(jié)果顯示，仔豬特異性抗體水平顯著的高于對照組；并且免疫母豬所產(chǎn)的仔豬被免疫后，攻毒時不產(chǎn)生臨床癥狀或全身性的損害；相反，未免疫母豬所產(chǎn)的仔豬免疫后，攻毒時表現(xiàn)出中樞神經(jīng)癥狀和跛行。因此免疫母豬的作用是非常關鍵。

2．藥物預防。萬遂如等在實際生產(chǎn)中總結(jié)了很有效的藥物預防方案，每噸飼料中加入300 g氟苯尼考、200 g阿莫西林，連續(xù)喂14 d。妊娠母豬每噸飼糧中加入利高霉素1 kg，阿莫西林200 g，分娩前后各喂7 d。哺乳仔豬分別在1日齡、7日齡肌肉注射頭孢噻呋0.2 ml，21日齡注射0.4 ml。仔豬每噸飼糧中加入80%支原凈100 g、強力霉素150 g，于斷奶前后各喂7 d，同時配合每噸水中加阿莫西林150 g，連飲14 d。另外可在飲水中加一些抗應激的藥物如維生素C等，可以增強預防效果，可有效防止本病的發(fā)生。

（三）治療發(fā)生疫情時，要及時隔離病豬，病死豬作無害化處理，控制好傳染源，以免疫情擴散。在發(fā)病初期采取非腸道給藥途徑對整個豬群用大量抗菌素進行預防，對有臨床癥狀的豬只要適當加大用量，以保證藥物及時滲透到腦脊髓液及關節(jié)中。可選用頭孢氨芐、阿莫西林、氨芐西林等抗菌藥每隔6～8 h進行肌肉注射，并配合地塞米松增強效果。但由于副豬嗜血桿菌的血清型多，且不同菌株的抗藥性不同，所以最好對引起病癥的病原體做藥物敏感試驗，采用敏感藥物可以快速有效的控制疫病在豬群中蔓延，而且可以避免盲目用藥引起的細菌變異以及經(jīng)濟損失。另外，豬場要按照科學的免疫程序做好豬瘟、偽狂犬病、藍耳病、豬肺疫、豬丹毒、豬傳染性胸膜肺炎及氣喘病等疫病的免疫接種，使豬群常年處于良好的免疫狀態(tài)，也可有效地防止副豬嗜血桿菌病在豬場的繼發(fā)感染。

五、展望

目前，副豬嗜血桿菌感染已由原先的零星散發(fā)變?yōu)榇笠?guī)模的暴發(fā)流行，對養(yǎng)豬業(yè)的危害正日益加重。隨著副豬嗜血桿菌的診斷，流行病學等方面已取得了重大成就，研究者可以快速，準確的掌握特定豬場中病原的流行病學等相關信息，但是HPS是一種機會致病菌，只在與其他病毒或細菌協(xié)同時才會致病，因此制定必要的免疫接種、藥物預防同時還要配合以優(yōu)良的管理措施, 防控其他病原體，完全可以預防豬群感染副豬嗜血桿菌在豬場中的廣泛流行。今后，在確定毒力因子、闡述其致病機理以及獲得保護性免疫的機制、以及研制廣譜的疫苗等方面都還需要研究工作者進行深入研究。

（略）