北京市海淀區(qū)藥品檢驗(yàn)所(100083） 饒金華

北京市垂楊柳醫(yī)院（100022）陸紅柳

北京市海淀區(qū)藥品檢驗(yàn)所(100083）李東輝 王永欣

非法添加化學(xué)藥指在中成藥中添加與此中成藥療效相似或者一致的西藥成分，以提高療效、增加銷量的一種不法行為。檢測中成藥中是否非法添加化學(xué)藥的工作至關(guān)重要。中藥制劑通常含有多種中藥材，每種藥材的成分又復(fù)雜多樣，鑒別檢查此類復(fù)雜化學(xué)環(huán)境中非法添加的化學(xué)成分，選擇專屬性高的分析手段尤為關(guān)鍵，液相色譜-質(zhì)譜法（LS-MS）由于具有高度專屬性，成為國內(nèi)外研究普遍采用的方法?，F(xiàn)將有關(guān)研究近況綜述如下：

1 液相色譜-質(zhì)譜法原理及應(yīng)用

HPLC-MS 是當(dāng)前鑒別檢查中藥制劑中摻入化學(xué)藥物的有效分析方法之一。由于其分析不需要實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)與干擾組分的完全色譜分離,可以通過對質(zhì)荷比的篩選得到單一組分的色譜圖，同時(shí)還可以通過二級質(zhì)譜分析對結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步確證。更重要的是,常規(guī)的HPLC分析時(shí)，如果手頭沒有相應(yīng)的對照品，實(shí)驗(yàn)就很難開展，但HPLC-MS 可從得到的質(zhì)譜信息中篩選出供試品中各組分的準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比，從而推斷其分子量，將得到的分子量信息與相關(guān)文獻(xiàn)資料比較,從中可以發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的信息。事實(shí)上,質(zhì)譜相當(dāng)于一種特殊的HPLC檢測器。色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析，而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。

2002年，美國質(zhì)譜協(xié)會統(tǒng)計(jì)了藥物色譜分析各種不同方法所占的比例。1990年，HPLC高達(dá)85%，而2000年下降到15%，相反，LC-MS所占的份額從3%提高到大約80%。我國目前在這方面相當(dāng)于美國九十年代的水平，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)在我國有著廣泛的發(fā)展空間。

2 具體應(yīng)用

2.1 止咳平喘類制劑的檢查 劉起中等采用XTerra C18柱(5μm,2.1 mm ×150 mm)，以甲醇-10mmol/L醋酸胺溶液為流動相，以梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。通過與對照品的液相色譜保留時(shí)間、相對分子質(zhì)量、二級質(zhì)譜信息比較，對治療哮喘中藥制劑中非法摻入的化學(xué)藥物進(jìn)行鑒別，分別檢測到沙丁胺醇、茶堿、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松四種化學(xué)藥物。夏瑞、車寶泉、張喆等建立了鑒別中藥制劑中可能添加的糖皮質(zhì)激素的液相色譜-質(zhì)譜分析方法。針對不同的中藥劑型，采用不同的試樣處理方式。提取后的樣品溶液采用Diamond C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分離，以流動相A （水-四氫呋喃,體積比為100∶1）和B （乙腈-水-四氫呋喃，體積比為80∶20∶1）進(jìn)行梯度洗脫。通過與對照品保留時(shí)間、一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜圖的對比進(jìn)行定性。應(yīng)用該法鑒定了中藥制劑中的糖皮質(zhì)激素，在供試品溶液中檢出了醋酸潑尼松等15種糖皮質(zhì)激素。張西如、姜建國、張素萍等采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。選用VenusilMP C18柱，以0.01mol·L-1醋酸銨（含0.1%醋酸） -乙腈（60∶40）為流動相，對非法添加醋酸潑尼松的復(fù)方川羚定喘膠囊制劑的提取液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。通過與對照品的色譜、紫外及質(zhì)譜行為相比較，對此類非法添加醋酸潑尼松的藥物進(jìn)行定量測定和定性鑒別。結(jié)果在這些制劑中均檢出醋酸潑尼松，且回收率為98.62% （n=6）。

2.2 降糖類制劑的檢查 董宇、孔璋、鐘大放等采用液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法。選用Diamonsil C18柱，以乙腈-水-甲酸（V ∶V ∶V=60.0∶40.0∶0.1）為流動相，對中藥降糖制劑的提取液進(jìn)行液相色譜-離子阱質(zhì)譜分析。通過與對照品的色譜及質(zhì)譜行為相比較，對中藥降糖制劑中非法摻入的合成降糖藥進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果在4種受試中藥降糖制劑中，2種被檢測到同時(shí)摻有苯乙雙胍和格列本脲，1 種被檢測到摻有格列本脲。鄭成、向智敏等以Altima C18色譜柱為固定相，以乙腈-0.1%甲酸溶液（65：35）為流動相，用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性分析鑒定。

結(jié)果顯示，在一批降糖膠囊中檢測到非法摻入的化學(xué)藥格列本脲和苯乙雙胍。程顯隆、劉卉等以Agilent C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分離，以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動相，流速為1.0ml/min）分流比為4：1。采用電噴霧離子化正離子檢測模式（ESI＋），m/z范圍為100-800amu，毛細(xì)管電壓為＋3.2kV，脫溶劑氣（N2）為350L/h，錐孔反吹氣為50L/h，錐孔電壓為45V，脫溶劑溫度為150℃，源溫度為105℃，檢測方式為全掃描質(zhì)譜。根據(jù)液相色譜保留時(shí)間、相對分子質(zhì)量及源內(nèi)CID（碰撞誘導(dǎo)裂解）碎片離子等信息，對中藥降糖制劑及膠囊殼的提取液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，在市售某中藥降糖制劑中檢測到羅格列酮。吳美香、李煥德采用HPLC-MS 法，質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離正離子源(ESI +)，毛細(xì)管噴口電離電壓3kV，孔電壓45 V，離子源溫度105℃，去溶劑氣溫260℃，去溶劑氣流速420L/h。采用選擇離子監(jiān)測（SIR）模式進(jìn)行定性分析。色譜柱:Thermo TM C8（250 mm ×4.6mm，5μm），柱溫40℃，檢測波長230 nm，流動相梯度洗脫程序：乙腈-30 mmoL/L 醋酸銨溶液(5∶95～30∶70,0～20 min)，(30∶70～65∶35，20～40min)，（65∶35～5∶95,40～45 min），（5∶95，45～50 min）,流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量20μl。

結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的條件能夠把中藥制劑中添加的磺酰脲類（格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮） 和4 種硝基咪唑類藥物（甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、塞克硝唑) 同時(shí)完全分離開來。對8種制劑建立的檢測技術(shù)進(jìn)行了分析，經(jīng)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，得到有2種中成藥中非法摻有降糖化學(xué)藥品格列本脲：有2 種中成藥制劑同時(shí)非法摻入了降糖化學(xué)藥品格列本脲和格列齊特。

2.3 抗風(fēng)濕類制劑的檢查 劉福艷、謝元超等采用Agilent C18柱(5μm,150 mm ×4.6 mm)分離，以0.02mol/L醋酸胺-1%醋酸溶液-甲醇（32：3：65）為流動相，流速為0.4ml/min，柱溫30℃。采用電噴霧離子化負(fù)離子檢測模式（ESI－），m/z范圍為100-400amu，干燥器溫度350℃；干燥氣流速10L/min；干燥氣壓力為276kPa；源電壓為5kV。通過液相色譜保留時(shí)間、一級及二級質(zhì)譜碎片等信息，對抗風(fēng)濕類中藥的提取液中非法摻入的萘普生、吲哚美辛進(jìn)行定性鑒別，在6批抗風(fēng)濕類中藥中3批檢出萘普生，其中2批同時(shí)檢出吲哚美辛。

2.4 降壓類制劑的檢查 高青、張喆、車寶泉等采用Waters Sunfire C18色譜柱，梯度洗脫：流動相A為20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇-乙腈（2∶1）,檢測波長為230nm,流速為1 ml·min-1（分流比為4∶1）。選擇正負(fù)離子全掃描方式檢測臨床常用的15種降壓藥，利用質(zhì)譜解析軟件研究了上述化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。通過比較樣品峰與對照品峰的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜質(zhì)荷比，確定樣品中是否摻雜了化學(xué)藥物。結(jié)果在上述色譜及質(zhì)譜條件下，15種降壓藥物HPLC圖譜分離度良好，質(zhì)譜分辨率符合鑒別要求。HPLC-MS/MS方法測定上述化學(xué)物質(zhì)的最小檢出量為1～80ng。

2.5 減肥類制劑的檢查 車寶泉、張喆、黃曉君采用UtimatesXB-C18色譜柱，梯度洗脫：流動相A為含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇，流速為1 ml·min-1。選擇正負(fù)離子全掃描方式檢測臨床常用的10種減肥藥，利用質(zhì)譜解析軟件研究了上述化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過比較樣品峰與對照品峰的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜質(zhì)荷比,確定樣品中是否摻雜了化學(xué)藥物。結(jié)果檢出西布曲明、芬氟拉明、酚酞。樣品各色譜峰間分離度良好，質(zhì)譜分辨率符合要求,最小檢出量為2～100ng。王珂等采用Agilent C18柱(5μm,150mm ×2.1mm)分離，分別以不同比例的0.5%甲酸溶液-乙腈或0.5%甲酸溶液-甲醇進(jìn)行梯度洗脫：流動相A為含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇，流速為1ml·min-1。質(zhì)譜條件：離子源ESI，霧化氣壓力2.07×105Pa，干燥器溫度350℃；干燥氣流速8L/min，自動掃描方式。結(jié)果在1000批供試品中分別檢測到西布曲明、芬氟拉明、咖啡因、番瀉苷、酚酞等。

2.6 蘇丹紅系列染料的檢查 馮家力、王一紅、丁力等建立了蘇丹紅系列染料（蘇丹I、蘇丹II、蘇丹III、蘇丹IV） 靈敏、專一的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法。將樣品用乙腈提取過濾后，無需其他處理，直接用95 %乙腈+5 %水（含0.1 %甲酸） 為流動相進(jìn)行反相液相色譜分離，用電噴霧正離子源進(jìn)行離子化，選擇反應(yīng)監(jiān)測方式（SRM）對這4種物質(zhì)各自的母離子（m/ z249、277、353、381） 及其4對子離子（m/ z232和93、121 和106、197和92、225 和106)進(jìn)行監(jiān)測,三級四極質(zhì)譜測定;用全掃描方式對每種物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。

結(jié)果表明，樣品處理極其簡單，7min內(nèi)完成分離，方法抗干擾能力強(qiáng)，回收率98 %～103 %，檢出限0.02～0.04μg/ L，RSD0.8 %～1.6 %，相關(guān)系數(shù)0.9993～0.9998；同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)食品中添加有與蘇丹III 和IV結(jié)構(gòu)極其近似的同分異構(gòu)體存在，且其同分異構(gòu)體也為紅色物質(zhì)。

3 總結(jié)

針對不法藥品生產(chǎn)廠家在中成藥中非法添加化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)狀，各藥檢部門一般采用化學(xué)方法、薄層色譜、液相色譜等進(jìn)行初篩，而后用液質(zhì)聯(lián)用等手段進(jìn)行確證定量，建立了一系列分析方法。HPLC-MS方法已經(jīng)成為了“非法添加化學(xué)藥”定量檢測的首選方法,為打擊藥品制假和保障用藥安全提供了有力的技術(shù)支持。