趙心清，白鳳武，李寅

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)研究在生物燃料生產(chǎn)菌株改造中的應(yīng)用

趙心清1，白鳳武1，李寅2

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024 2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

基于生物質(zhì)資源生產(chǎn)環(huán)境友好的生物燃料，對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，但其生產(chǎn)成本高的問題十分突出，而高效生產(chǎn)菌株的獲得是解決這一問題的根本出路。以下綜述了利用系統(tǒng)生物學(xué)研究所獲得的信息進(jìn)行菌種改造的過程，重點(diǎn)論述了生產(chǎn)菌株脅迫耐受性方面的研究進(jìn)展，并討論了系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)在改造生物燃料生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用，展望了合成生物學(xué)在構(gòu)建高效生物能源生產(chǎn)菌株方面應(yīng)用的前景。

系統(tǒng)生物學(xué)，合成生物學(xué)，代謝工程，生物燃料，菌株改造

Abstract:Biofuels are renewable and environmentally friendly, but high production cost makes them economically not competitive, and the development of robust strains is thus one of the prerequisites.In this article, strain improvement studies based on the information from systems biology studies are reviewed, with a focus on their applications on stress tolerance improvement.Furthermore, the contribution of systems biology, synthetic biology and metabolic engineering in strain development for biofuel production is discussed, with an expectation for developing more robust strains for biofuel production.

Keywords:systems biology, synthetic biology, metabolic engineering, biofuels, strain improvement

⑩Louis D．Brandeis，Other People’s Money and How The Bankers Use IT，Martino Publishing，1988，p．92．

與石油基液體燃料相比，生物燃料不僅生產(chǎn)原料是可再生的生物質(zhì)資源，而且燃燒產(chǎn)生的 CO2可以被植物光合作用吸收，可顯著降低溫室氣體的凈排量，對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義，因此得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者和政府的高度重視。然而，目前生物燃料生產(chǎn)成本過高的問題仍然十分突出，以燃料乙醇為例，在美國(guó)燃料乙醇生產(chǎn)主要靠政府的稅收優(yōu)惠政策，而我國(guó)的燃料乙醇生產(chǎn)則依賴國(guó)家直接財(cái)政補(bǔ)貼。

二是建立健全群眾監(jiān)督機(jī)制。深入推進(jìn)黨務(wù)公開工作，健全和完善黨內(nèi)外情況反映制度、征求意見制度等，通過設(shè)立領(lǐng)導(dǎo)接待日、設(shè)置意見郵箱等，為群眾監(jiān)督提供便利的反映渠道。通過開展問卷調(diào)查、滿意度測(cè)評(píng)等方式，組織服務(wù)對(duì)象對(duì)機(jī)關(guān)黨組織和黨員的服務(wù)工作開展評(píng)價(jià)。利用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)和微博、微信、QQ、郵箱等溝通載體，逐步建立服務(wù)群眾網(wǎng)上平臺(tái)，提高監(jiān)督反饋的時(shí)效性。健全相應(yīng)的工作保障機(jī)制,推動(dòng)整改與反饋，使師生監(jiān)督產(chǎn)生實(shí)效。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料的生產(chǎn)成本主要由原料成本和能耗成本構(gòu)成。使用廉價(jià)易得的以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料，替代成本高而且潛在影響糧食安全的淀粉質(zhì)原料，是降低生物燃料生產(chǎn)原料成本的根本出路，但纖維素類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化還存在效率低等諸多問題[1-2]。提高發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)物濃度，節(jié)省后續(xù)分離的能耗及廢糟液量，進(jìn)而節(jié)省廢糟液處理的能耗，以及提高發(fā)酵溫度，使發(fā)酵系統(tǒng)在夏季高溫季節(jié)可以使用循環(huán)冷卻水替代能耗高、設(shè)備投資大的低溫冷卻水，節(jié)省發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行能耗，是節(jié)省能耗的兩個(gè)主要方向。不論是拓寬發(fā)酵底物利用廉價(jià)的原料，還是提高發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)物濃度和發(fā)酵溫度，都有賴于構(gòu)建性能優(yōu)良的菌株。

近年來，利用系統(tǒng)生物學(xué)研究獲得的信息深入理解環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞生理代謝的影響，并指導(dǎo)代謝工程操作，以及基于合成生物學(xué)理論，定向設(shè)計(jì)全新的代謝途徑，都取得了很大進(jìn)展。本文綜述了這些研究在構(gòu)建生物燃料高效生產(chǎn)菌株方面的進(jìn)展，并展望了系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)研究在構(gòu)建高效生物燃料生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。

1 系統(tǒng)生物學(xué)與生物燃料生產(chǎn)菌種構(gòu)建

1.1 系統(tǒng)生物學(xué)方法改造菌株與傳統(tǒng)方式的比較

傳統(tǒng)方法改造菌株往往通過菌種的多次隨機(jī)誘變和定向篩選，或者通過菌種的馴化獲得優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，但存在的問題是改造過程隨機(jī)性很大，因此非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)菌種性能提高的機(jī)制認(rèn)識(shí)不足。隨著人們對(duì)代謝途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，代謝工程技術(shù)得到了較快發(fā)展，通過過量表達(dá)或敲除代謝途徑關(guān)鍵酶基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的定向優(yōu)化[3]。如Ingram小組通過在大腸桿菌中過量表達(dá)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶PDC和乙醇脫氫酶ADH2，成功構(gòu)建了工程菌種KO11，其乙醇發(fā)酵速率與釀酒酵母接近[4]。然而代謝工程操作對(duì)于多基因決定的性狀難以實(shí)現(xiàn)理想的效果，尤其是對(duì)于控制機(jī)制不是很清楚的代謝途徑，無法找到合適的基因靶點(diǎn)進(jìn)行操作。反向代謝工程的發(fā)展通過對(duì)性能提高的突變體的代謝途徑進(jìn)行分析，尋找提高菌株生理性能的關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)代謝途徑的定向改造，也取得了一定成功[5]。近年來發(fā)展的基因組改組(Genome shuffling)[6]和全局轉(zhuǎn)錄工程機(jī)制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)[7]為菌種改造提供了新的思路，即通過對(duì)菌株基因組規(guī)模的重組或者基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)錄水平的控制獲得代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化的菌株，但以上這些操作仍然涉及到突變的不定向性和對(duì)大量突變體進(jìn)行篩選。而且，由于細(xì)胞內(nèi)部代謝網(wǎng)絡(luò)的相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制的存在，一些與代謝途徑表面上似乎沒有關(guān)系的基因，其表達(dá)水平或者表達(dá)產(chǎn)物也可能對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化具有重要的影響，同時(shí)，過量表達(dá)某一個(gè)基因或者某幾個(gè)基因可能引起代謝網(wǎng)絡(luò)整體平衡的失調(diào)，從而影響代謝工程的成功[8]。因此，如何尋找這些影響代謝途徑優(yōu)化的關(guān)鍵基因，并且達(dá)到對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡調(diào)控，是代謝工程操作的重要研究?jī)?nèi)容。

系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)可以使人們從基因組規(guī)模去全面理解細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，包括組成代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因、細(xì)胞代謝復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，以及遺傳和環(huán)境擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞全局代謝的影響，從而建立組學(xué)規(guī)模的代謝模型，對(duì)可能的基因工程操作效果進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)，并通過對(duì)基因工程操作后獲得的菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)分析，從而更好地指導(dǎo)代謝工程操作手段，改善細(xì)胞的生理功能和生產(chǎn)性狀[8]。系統(tǒng)生物學(xué)研究涉及到生物信息學(xué)、數(shù)學(xué)、分子生物學(xué)以及化學(xué)工程學(xué)等多學(xué)科的交叉和整合，使人們對(duì)復(fù)雜生命現(xiàn)象的了解更加全面和深入。利用系統(tǒng)生物學(xué)研究思想指導(dǎo)菌株改造的流程見圖1。

系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展的不同階段出現(xiàn)了不同的名詞，包括系統(tǒng)生物技術(shù)[9]、系統(tǒng)代謝工程[10]和最新提出的工業(yè)系統(tǒng)生物學(xué)[11]等。這些名詞代表了系統(tǒng)生物學(xué)研究不同階段的不同側(cè)重點(diǎn)，現(xiàn)分別討論如下：

隨著我國(guó)社會(huì)及經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，商品外包裝已經(jīng)不再是單純的包裝作用，還應(yīng)能通過商品外包裝體現(xiàn)出商品自身的文化特質(zhì)、質(zhì)量特點(diǎn)等，進(jìn)而確保這些商品能更好的在市場(chǎng)上占據(jù)一席之地。陶瓷在現(xiàn)代酒類包裝設(shè)計(jì)中的應(yīng)用將能更好的提升商品包裝的價(jià)值。使用陶瓷作為酒類產(chǎn)品包裝容器，消費(fèi)者不需要將商品包裝作為廢品進(jìn)行處理，陶瓷器具本身具備非常高的藝術(shù)欣賞價(jià)值。結(jié)合這些內(nèi)容來說，除了提升商品質(zhì)量之外，保證商品外包裝的價(jià)值和品質(zhì)也是非常重要的，因此，在現(xiàn)代酒類包裝設(shè)計(jì)過程中，相關(guān)設(shè)計(jì)人員應(yīng)能將陶瓷器具及陶瓷元素等靈活的應(yīng)用起來。

系統(tǒng)生物技術(shù)(Systems biotechnology)[9]：利用系統(tǒng)生物學(xué)的高通量組學(xué)數(shù)據(jù)建立代謝模型，設(shè)計(jì)具有優(yōu)化的代謝能力的細(xì)胞，強(qiáng)調(diào)各種組學(xué)工具在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，以及借助組學(xué)工具，在對(duì)細(xì)胞在不同遺傳和環(huán)境條件擾動(dòng)下的整體代謝水平變化理解的基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝模型的構(gòu)建和修飾。

[3]Na D, Kim TY, Lee SY.Construction and optimization of synthetic pathways in metabolic engineering.Curr Opin Microbiol, 2010, 13: 363?370.

工業(yè)系統(tǒng)生物學(xué)(Industrial systems biology)[11]：利用系統(tǒng)生物學(xué)研究手段建立可預(yù)測(cè)的基因組規(guī)模代謝模型，并提出有效的改造策略，提高基因組信息已知的工業(yè)生產(chǎn)宿主的生產(chǎn)能力和生產(chǎn)效率，提高工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)性和可持續(xù)性發(fā)展能力。強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)生物學(xué)在生產(chǎn)工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品中的應(yīng)用，注重組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，以提高代謝模型的可預(yù)測(cè)性，并進(jìn)行代謝工程操作的有效性開發(fā)。

可以看出，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)工具在工業(yè)生產(chǎn)宿主選育中的應(yīng)用也從最初的單一組學(xué)研究，到多種組學(xué)工具的聯(lián)合使用和數(shù)據(jù)整合；從定性研究生物系統(tǒng)，到對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行定量分析和基因組規(guī)模模型建立；從對(duì)生產(chǎn)宿主在不同環(huán)境條件和遺傳擾動(dòng)下細(xì)胞內(nèi)部變化的理解，到利用所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行菌種改造和過程優(yōu)化。

1.2 釀酒酵母的系統(tǒng)生物學(xué)研究與燃料乙醇生產(chǎn)

釀酒酵母是燃料乙醇生產(chǎn)最常用的工業(yè)宿主。對(duì)釀酒酵母的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究獲得了很多有用的信息，為指導(dǎo)高效燃料生產(chǎn)菌種構(gòu)建的代謝工程操作奠定了基礎(chǔ)。Jens Nilson研究小組構(gòu)建了釀酒酵母基因組規(guī)模的系統(tǒng)生物學(xué)模型，并設(shè)計(jì)了降低甘油產(chǎn)率提高乙醇收率的代謝工程操作策略，進(jìn)一步的代謝工程操作證明，在釀酒酵母中過量表達(dá)鏈球菌Streptococcus mutants的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPN獲得的突變體，甘油收率下降了40%，乙醇收率提高了 3%，在混合糖發(fā)酵基因工程菌中過量表達(dá)該基因，利用葡萄糖、木糖混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的收率提高了25%[12]。瑞典Lund University的研究小組對(duì)所構(gòu)建的重組酵母與對(duì)照菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在木糖上生長(zhǎng)較好的菌株中有 13個(gè)基因在所有重組菌中變化都比較明顯，并進(jìn)一步進(jìn)行了這些基因的過量表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中 5個(gè)基因的操作提高了在木糖上的有氧生長(zhǎng)，最明顯的提高了173%[13]。

對(duì)在木糖上發(fā)酵良好的菌株S.cerevisiaeTMB3400與親本菌株進(jìn)行了蛋白組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)突變體中木糖脫氫酶、木糖還原酶以及TKL1和ALD6等酶基因的表達(dá)明顯上調(diào)，與前期對(duì)突變體的理性遺傳改造設(shè)計(jì)相符合，值得指出的是，該研究發(fā)現(xiàn)蛋白組研究的結(jié)果與同等實(shí)驗(yàn)條件下的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果不相符，表明釀酒酵母蛋白的翻譯后修飾或者轉(zhuǎn)錄后修飾過程對(duì)代謝的影響較大[14]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)在突變體和對(duì)照菌種中存在非釀酒酵母來源的蛋白，說明工業(yè)菌株中的蛋白和基因組成存在異質(zhì)性，即工業(yè)微生物菌種與實(shí)驗(yàn)室菌種存在基因組組成的差異。類似的結(jié)論也在其他研究中有所報(bào)道，如美國(guó)杜克大學(xué)對(duì)巴西利用甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)酵母JAY270和其單倍體菌株JAY291的基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)室模式酵母菌種S288C相比較，JAY270菌株的染色體結(jié)構(gòu)存在明顯差異，包括6號(hào)染色體上有9.1 kb和19.3 kb的大片段而在S288C中沒有發(fā)現(xiàn)，此外在JAY270中某些基因拷貝數(shù)增加，如負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)重要的小分子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)循環(huán)的SAM4和SAM5基因在S288C中有2個(gè)拷貝，但在JAY270中有4個(gè)拷貝；負(fù)責(zé)微生物B6代謝的SNO2和SNZ2基因在JAY270中有9個(gè)拷貝，而在S288C中只有4個(gè)拷貝，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SNO2和SNZ2的表達(dá)在JAY270中也明顯高于模式酵母，而這兩個(gè)基因與細(xì)胞的氧化脅迫有關(guān)，其拷貝數(shù)的增加可能與 JAY270較強(qiáng)的耐受氧化脅迫的性能有關(guān)。另外HAP1調(diào)控的基因在JAY270中的表達(dá)也明顯高于 S288C，這些基因與發(fā)酵過程密切相關(guān)[15]。以上結(jié)果都表明，在工業(yè)酵母中存在有利于其進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵和抵抗工業(yè)生產(chǎn)過程中的脅迫耐受性的基因組成和表達(dá)調(diào)控方式，在構(gòu)建基因組規(guī)模代謝模型的時(shí)候，應(yīng)該充分考慮工業(yè)菌種與實(shí)驗(yàn)室模式菌種的差異，以及不同酵母菌株間的差異，從而得到更完善的模型。

1.3 系統(tǒng)生物學(xué)在生物燃料生產(chǎn)菌耐性研究中的應(yīng)用

系統(tǒng)生物學(xué)能提供對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)的深刻認(rèn)識(shí)，因此對(duì)多基因控制的性狀的研究能起到重要的推動(dòng)作用。生物燃料生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌可能經(jīng)歷各種脅迫因素的壓力，首先燃料乙醇和生物丁醇等生物燃料本身對(duì)細(xì)胞就具有很大的毒性；其次，生產(chǎn)菌在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中可能遇到的高溫和低pH等條件，原料水解物中存在的抑制性化合物，如糠醛、乙酸等[16-17]。提高生產(chǎn)菌對(duì)這些環(huán)境條件的耐受性，有助于提高發(fā)酵終點(diǎn)的產(chǎn)物濃度，同時(shí)降低生產(chǎn)的能耗，對(duì)于生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性具有重要意義。近年來對(duì)釀酒酵母和梭菌等生物燃料生產(chǎn)菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究結(jié)果對(duì)于深入了解細(xì)胞在環(huán)境脅迫下的反應(yīng)，尋找關(guān)鍵基因進(jìn)行代謝工程改造奠定了基礎(chǔ)[18-28]。雖然早期對(duì)實(shí)驗(yàn)室菌株的研究集中在短暫乙醇沖擊下細(xì)胞全局基因轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)，但對(duì)工業(yè)酵母在工業(yè)發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，不同菌株對(duì)乙醇脅迫的反應(yīng)存在一定的可比性[18]，如乙醇脅迫下，細(xì)胞能量代謝、脂類代謝、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因均表達(dá)上調(diào)，值得指出的是，即使在過量糖存在條件下，糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑相關(guān)的很多基因的表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)，表明細(xì)胞在乙醇脅迫下能量代謝對(duì)細(xì)胞活性是非常關(guān)鍵的。

[6]Shi DJ, Wang CL, Wang KM.Genome shuffling to improve thermotolerance, ethanol tolerance and ethanol productivity ofSaccharomyces cerevisiae.J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36: 139?147.

值得提出的是，在系統(tǒng)生物學(xué)研究過程中，對(duì)細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等組學(xué)研究將獲得大量的信息，因此只有對(duì)所獲得的信息進(jìn)行深入挖掘和整合，才有可能充分利用這些信息指導(dǎo)進(jìn)一步的基因工程操作。Bonneau等提出了通過對(duì)不同環(huán)境因素下基因組表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化的研究尋找控制細(xì)胞功能網(wǎng)絡(luò)模塊的轉(zhuǎn)錄因子的路線，對(duì)400多個(gè)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了包括72個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和 9個(gè)環(huán)境因子的模型，成功預(yù)測(cè)了未知環(huán)境影響下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化，證明了雖然復(fù)雜生物系統(tǒng)的描述給系統(tǒng)生物學(xué)研究帶來了挑戰(zhàn)，但細(xì)胞內(nèi)部代謝網(wǎng)絡(luò)的變化與外部的環(huán)境擾動(dòng)存在可預(yù)見的主要模式[29]，同時(shí)，這項(xiàng)研究也提示了利用系統(tǒng)生物學(xué)工具研究生物燃料生產(chǎn)菌的構(gòu)建須緊密結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際環(huán)境條件，強(qiáng)調(diào)了工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)環(huán)境下菌株的生理性能在菌株構(gòu)建中的重要作用[2]。

2 合成生物學(xué)研究與生物燃料生產(chǎn)

雖然系統(tǒng)生物學(xué)可加深人類對(duì)復(fù)雜系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，但系統(tǒng)生物學(xué)研究往往揭示了多個(gè)基因?qū)?fù)雜系統(tǒng)的調(diào)控，而對(duì)于多基因控制的系統(tǒng)進(jìn)行代謝工程改造還存在周期長(zhǎng)、效率低的問題，因而菌種的選育往往還需要依賴傳統(tǒng)的誘變、雜交以及菌種馴化等手段。雖然基因組改組和全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程等技術(shù)可加快對(duì)微生物進(jìn)行全基因組規(guī)模的改造，但這些操作仍然屬于非定向的改造，因此仍需要篩選大量的突變體。如果說系統(tǒng)生物學(xué)工具使人們可以最大限度地利用細(xì)胞的合成潛能，那么合成生物學(xué)的發(fā)展使人們可以利用物理學(xué)方法類似的模塊構(gòu)建和組裝形成新的生命有機(jī)體，從而人工設(shè)計(jì)新的高效生命系統(tǒng)進(jìn)行生物燃料的生產(chǎn)。2010年5月，美國(guó)生物學(xué)家Venter實(shí)驗(yàn)小組宣布成功創(chuàng)造了世界上首個(gè)人造生命，即人工合成的1.08 Mbp絲狀支原體Mycoplasma mycoidesJCVI-syn1.0基因組在山羊支原體Mycoplasma capricolum細(xì)胞中成功表達(dá)，使這一新產(chǎn)生的生命能自我生長(zhǎng)、繁殖，這是合成生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑[30]，標(biāo)志著人工制造生命體的技術(shù)已進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。

2.1 合成生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)和代謝工程

[9]Lee SY, Lee DY, Kim TY.Systems biotechnology for strain improvement.Trends Biotechnol, 2005, 23: 349?358.

戴威的經(jīng)歷堪稱天之驕子，曾是北京大學(xué)學(xué)生會(huì)主席，創(chuàng)辦ofo時(shí)就立志要改變世界。戴威以30億元財(cái)富排名《2018胡潤(rùn)80后富豪榜》第32位，可以說是最著名的90后創(chuàng)業(yè)者和企業(yè)家。

合成生物學(xué)與代謝工程操作存在部分交叉[33]。代謝工程操作可以合并來自不同生物的已有的途徑，并可以通過對(duì)已知途徑的改造生產(chǎn)新的產(chǎn)品，但合成生物學(xué)與代謝工程的最大差別是，合成生物學(xué)設(shè)計(jì)的代謝通路可以是全新的，不受已有生命系統(tǒng)中的代謝路徑的限制，即代謝途徑的每一步都可以獨(dú)立設(shè)計(jì)，目標(biāo)是通過模塊的搭建快速配置生物機(jī)器。這一點(diǎn)對(duì)于生物燃料的生產(chǎn)非常重要，因?yàn)闊o論是燃料乙醇、生物丁醇還是生物柴油，其生物合成都受到細(xì)胞內(nèi)部代謝的嚴(yán)格調(diào)控，而從頭設(shè)計(jì)代謝途徑可以避開這種代謝調(diào)控，而且可以在所設(shè)計(jì)的每一步反應(yīng)中使用來自不同宿主的酶，或者通過蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化獲得新的酶用于模塊的搭建。

系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)和代謝工程研究都可以促進(jìn)生物燃料的生產(chǎn)效率，但側(cè)重點(diǎn)有所不同。如利用廉價(jià)底物，包括木質(zhì)纖維素、糖蜜及其他農(nóng)林廢棄物等生產(chǎn)生物燃料的過程中，代謝工程操作著眼于宿主細(xì)胞已有代謝途徑的敲除和/或過量表達(dá)，以及對(duì)底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)過程的修飾，系統(tǒng)生物學(xué)的研究可提供宿主細(xì)胞已經(jīng)代謝工程改造后的突變體細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件和不同基因改造后的生理特征和產(chǎn)物合成情況，從而提供更多更有效的靶點(diǎn)用于代謝工程改造，而合成生物學(xué)則著眼于從頭設(shè)計(jì)全新的代謝途徑或全新的生命系統(tǒng)進(jìn)行生物燃料的生產(chǎn)，同時(shí)也可以通過模塊的優(yōu)化和重建，改造原有的生命系統(tǒng)，進(jìn)行生物燃料的有效生產(chǎn)。合成生物學(xué)與代謝工程的概念常被很多學(xué)者混淆，如在異源宿主中建立生物燃料的代謝途徑，早期的代謝工程研究已有很多這樣的例子，現(xiàn)在將其稱之為合成生物學(xué)研究，但是簡(jiǎn)單地通過基因工程手段引入新的代謝途徑，實(shí)質(zhì)上并沒有超越原來代謝工程定義的范疇。

供給情況：氮肥方面，尿素復(fù)產(chǎn)企業(yè)增多，整體開工率小幅上升至60%。磷肥方面，二銨企業(yè)開工率大穩(wěn)小動(dòng)，平均開工率小幅上升至67%。鉀肥方面，鹽湖基準(zhǔn)產(chǎn)品60%粉晶到站價(jià)與上周持平；港口鉀、邊貿(mào)鉀近期到貨均較少，市場(chǎng)供應(yīng)緊俏。復(fù)合肥方面，企業(yè)整體開工率保持穩(wěn)定，各地限產(chǎn)壓力不減，大型企業(yè)開工穩(wěn)定，多數(shù)小企業(yè)持續(xù)停產(chǎn)。

2.2 合成生物學(xué)模塊的優(yōu)化與生物燃料生產(chǎn)

目前合成生物學(xué)還處于發(fā)展的初期階段，其主要的限制性因素在于：1)對(duì)生物元件(包括酶蛋白和啟動(dòng)子等)特性的理解還不夠深入；2)所構(gòu)建的代謝通路的不可預(yù)測(cè)性，如對(duì)基因調(diào)節(jié)元件的不可控制性；3)多個(gè)條件環(huán)路存在時(shí)構(gòu)建與檢測(cè)的復(fù)雜性；4)不同元件的不可協(xié)調(diào)性；5)不同細(xì)胞間的可變性，由于細(xì)胞生理特性的差異導(dǎo)致構(gòu)建的效果不一致[34]。但近期相關(guān)研究為利用合成生物學(xué)研究生產(chǎn)生物燃料奠定了良好基礎(chǔ)。利用合成生物學(xué)研究生物燃料生產(chǎn)有兩個(gè)重要組成因素：一個(gè)是所使用的宿主細(xì)胞，其次是所針對(duì)的代謝途徑[35]。利用大腸桿菌和酵母菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)生物燃料的代謝工程操作已取得了很大的進(jìn)步，但藻類生物也將成為生物燃料生產(chǎn)的有利宿主。美國(guó)學(xué)者James Liao 實(shí)驗(yàn)室將 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因在細(xì)長(zhǎng)聚球藻Synechococcus elongatusPCC7942中過量表達(dá)，使這種藍(lán)藻可以直接利用光能和CO2生產(chǎn)異丁醇[36]。與生物柴油不同，工程藻產(chǎn)生的異丁醇容易回收，生產(chǎn)過程無須經(jīng)過細(xì)胞破碎，極大地節(jié)省了成本，提高了生產(chǎn)效率，這也提示了藍(lán)藻可作為未來合成生物學(xué)手段構(gòu)建生物燃料生產(chǎn)宿主的一個(gè)理想選擇。值得指出的是，以上研究中得到的異丁醇作為長(zhǎng)鏈醇的一種，正成為新的生物燃料的研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈醇是指包括含有四碳或五碳的直鏈醇或支鏈醇，包括丁醇、異丁醇、異戊醇等。與乙醇相比，長(zhǎng)鏈醇具有更高的能量密度和更低的吸濕性，更適合作為汽油代替品。

[33]Prather KLJ, Martin CH.De novobiosynthetic pathways:rational design of microbial chemical factories.Curr opin Biotechnol, 2008, 19: 468?474.

在生物制氫研究方面，Zhang等利用13個(gè)酶的無細(xì)胞系統(tǒng)設(shè)計(jì)了自然情況下不存在的一系列反應(yīng)生產(chǎn)了氫氣，氫氣收率大大高于生物發(fā)酵制氫，而且反應(yīng)條件溫和(30℃，常壓)[39]。反應(yīng)中使用的這13個(gè)酶催化的途徑是從頭設(shè)計(jì)的，雖然這個(gè)工作利用的是無細(xì)胞體系，但這個(gè)設(shè)計(jì)思路可用于利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建能生產(chǎn)這些酶的細(xì)胞體系，從而實(shí)現(xiàn)利用廉價(jià)的底物合成相關(guān)酶系，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

3 展望

過去幾年見證了系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，以及系統(tǒng)生物學(xué)工具在生物燃料生產(chǎn)菌株構(gòu)建方面的應(yīng)用[40-42]。系統(tǒng)生物學(xué)研究揭示了宿主在不同的發(fā)酵環(huán)境條件下和不同遺傳改造后整體細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)整情況，有助于識(shí)別關(guān)鍵的靶基因進(jìn)行代謝工程改造。利用合成生物學(xué)手段定向設(shè)計(jì)和構(gòu)建高效生物燃料生產(chǎn)菌的研究還需要依賴系統(tǒng)生物學(xué)提供更多相關(guān)代謝途徑和生產(chǎn)宿主的特性信息，以及基因組規(guī)模代謝工程操作對(duì)生物燃料合成途徑的優(yōu)化。

未來生物燃料生產(chǎn)菌株改造的一個(gè)重要目標(biāo)是對(duì)木質(zhì)纖維素資源的高效生物轉(zhuǎn)化。纖維素是地球上來源最豐富的生物質(zhì)資源，可作為生物能源生產(chǎn)的廉價(jià)底物，降低大規(guī)模生產(chǎn)的成本。利用纖維素原料首先需要利用纖維素酶等降解酶系將纖維素分子轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵利用的糖，而里氏木霉Trichoderma reesei是重要的纖維素酶生產(chǎn)菌種，其基因組序列的公布為相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)[43]，但目前對(duì)絲狀真菌的組學(xué)研究還不夠深入，相關(guān)的基因組規(guī)模的代謝模型和基因組工程改造還處于起步階段[44]。隨著絲狀真菌遺傳改造系統(tǒng)的不斷完善，以及利用蛋白質(zhì)工程人工設(shè)計(jì)酶分子技術(shù)的進(jìn)步，提高纖維素酶的產(chǎn)量，以及優(yōu)化復(fù)合酶系統(tǒng)的組分比例，提高纖維素酶的活力等目標(biāo)將逐步實(shí)現(xiàn)，纖維素生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化將成為可能[45]。近年來通過異源表達(dá)纖維素酶降解酶系，已經(jīng)在不同宿主系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了纖維素原料的有效利用。美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Keasling研究組通過整合木聚糖酶基因?qū)崿F(xiàn)了在大腸桿菌生產(chǎn)生物柴油[46]，酵母菌細(xì)胞展示技術(shù)也可提供高效的降解酶系進(jìn)行燃料乙醇的生產(chǎn)[47]，這些代謝工程研究的成功為未來利用合成生物學(xué)手段建立高效纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞工廠提供了基礎(chǔ)。高效共發(fā)酵五碳糖和六碳糖的發(fā)酵菌株的構(gòu)建也是未來生物燃料生產(chǎn)宿主構(gòu)建的一個(gè)重點(diǎn)。自然環(huán)境中存在的某些微生物可以有效分解纖維素原料，尋找高效的降解酶系或者定向改造纖維素降解酶系，將為合成生物學(xué)構(gòu)建高效菌株提供更好的生物組件。

可以預(yù)見，隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和更多組學(xué)數(shù)據(jù)的獲得，以及合成生物學(xué)研究的不斷成熟，更高效的生物燃料生產(chǎn)宿主將成功構(gòu)建，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率將大幅度提高，生物能源生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性也將得到明顯提高，從而使生物燃料能得到更廣泛的生產(chǎn)和應(yīng)用。

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系統(tǒng)代謝工程(Systems metabolic engineering)[10]：即利用計(jì)算機(jī)工具建立的基因組規(guī)模計(jì)量模型和基因工程操作對(duì)細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)規(guī)模的代謝工程改造，以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。強(qiáng)調(diào)在對(duì)細(xì)胞代謝進(jìn)行基因組規(guī)模的整體認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝工程改造。

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與實(shí)驗(yàn)室菌株不同的是，工業(yè)菌株還存在長(zhǎng)期發(fā)酵條件下對(duì)脅迫條件的適應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的變化，而且相關(guān)基因很多都是在實(shí)驗(yàn)室酵母中沒有發(fā)現(xiàn)的功能未知的新基因[28]，這再次提示了不同菌株遺傳背景和不同的環(huán)境條件對(duì)組學(xué)研究結(jié)果的影響。對(duì)脅迫耐受菌株與野生型的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和/或蛋白組學(xué)比較研究，可發(fā)現(xiàn)與脅迫反應(yīng)和脅迫耐受性相關(guān)的基因和/或蛋白，加深對(duì)脅迫耐受機(jī)理的認(rèn)識(shí)，同時(shí)通過對(duì)關(guān)鍵靶基因的改造，可有效提高生產(chǎn)菌的脅迫耐受性。如對(duì)實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)釀酒酵母菌株在 5%乙醇中轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示，酪氨酸生物合成基因可能與乙醇耐性密切相關(guān)，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行過量表達(dá)或者添加酪氨酸，發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)乙醇的耐受性的確得到了提高[20]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乙醇、丁醇以及纖維素水解物中乙酸和糠醛等抑制性物質(zhì)對(duì)生產(chǎn)菌株全基因組的表達(dá)影響研究非?；钴S[20-28]，這些研究揭示了大量差異表達(dá)的基因和蛋白，為進(jìn)一步深入研究提高生產(chǎn)菌株的脅迫耐受性，選育生產(chǎn)效率提高的工業(yè)菌株提供了基礎(chǔ)。

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合成生物學(xué)的基本研究思路是利用生物零件(Parts)，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA、酶編碼基因等組裝成裝置(Devices)，即代謝途徑或調(diào)解環(huán)路，并將裝置進(jìn)一步組建成生命系統(tǒng)(Systems)，包括根據(jù)人類的意愿從頭設(shè)計(jì)合成新的生命過程或生命體，以及對(duì)現(xiàn)有生物體進(jìn)行重新設(shè)計(jì)[31]。合成生物學(xué)其核心是按照工程學(xué)的方法設(shè)計(jì)和改造生命系統(tǒng)，而且這個(gè)生命系統(tǒng)的特征是可以預(yù)測(cè)的。然而成功組建生命系統(tǒng)的前提是對(duì)復(fù)雜生命系統(tǒng)的深刻認(rèn)識(shí)。系統(tǒng)生物學(xué)研究所獲得的大量不同水平的信息可作為理解生命系統(tǒng)的基礎(chǔ)，在這個(gè)基礎(chǔ)上合成生物學(xué)才可能成功加工制作復(fù)雜的生物機(jī)器[32]。

一般情況下，曲折蜿蜒的天然河道是由淺灘和深槽兩種形態(tài)構(gòu)成，二者呈交替狀態(tài)分布。淺灘中常會(huì)有淤積，往往成為河道治理的重點(diǎn)，深槽則能保護(hù)水道與河床。除此之外，淺灘由于光照充足，成為兩棲動(dòng)物、鳥類繁衍和棲息的地方。深槽可為微生物提供良好的有機(jī)物分解空間，同時(shí)能夠滿足水生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給。河道由于溫度、光照及養(yǎng)料的供給，實(shí)現(xiàn)了生物物種的多樣性。

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田有園細(xì)細(xì)地跟易非說著，聽了他的話，易非仿佛才醒悟，如果按照自己的思路，她將來就只能睡在沙發(fā)上，媽要招呼小孫子，她能讓爸爸的長(zhǎng)孫睡在客廳里嗎？

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雖然循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA和microRNA、外泌體等新興血液生物標(biāo)志物檢測(cè)因其無創(chuàng)性和低風(fēng)險(xiǎn)性逐漸興起，但其臨床應(yīng)用仍然相對(duì)較少[10]，而血清腫瘤標(biāo)志物仍然是胰腺癌中應(yīng)用最為廣泛的生物標(biāo)志物[11]。

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李波：東川紅土地景區(qū)，位于東川西南部，原屬新田鄉(xiāng)和法者鄉(xiāng)，2005年兩鄉(xiāng)合并后改稱“紅土地鎮(zhèn)”。2011年昆明市成立“倘甸產(chǎn)業(yè)園區(qū)及轎子山旅游開發(fā)區(qū)”（簡(jiǎn)稱“兩區(qū)”），此后，紅土地鎮(zhèn)又交由“兩區(qū)”托管。紅土地景區(qū)分散，加起來大約100平方公里。景點(diǎn)主要有水坪子的梯田（月亮田），陷塘地的落霞溝，花溝的老龍樹，花石頭的錦繡園，大埡口的五彩地、還有119道班的打馬坎。

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有機(jī)硅也就是有機(jī)硅化合物，就是含有碳硅鍵的有機(jī)硅化合物，在所有生物分子中還沒有找到含碳硅鍵的化合物，所以它是一種特殊的高分子化工材料。

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●在五原縣豐裕鄉(xiāng)萬畝蜜瓜使用了硅谷功能肥，打造了萬畝“大蜜豐?！钡乩順?biāo)志產(chǎn)品。每畝增產(chǎn)20%，糖度增加2個(gè)點(diǎn)以上，經(jīng)有關(guān)部門現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)達(dá)到綠色無公害標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品被全國(guó)各地收購商搶購，創(chuàng)造了一年雙季蜜瓜的奇跡，每斤瓜高于市場(chǎng)價(jià)格0.5元，春季大棚密瓜畝收入13500元，創(chuàng)歷史新高。

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重建生物燃料合成途徑的一個(gè)典型例子是在酵母菌中對(duì)丁醇代謝途徑的搭建[37]。美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的 Keasling教授研究組研究了來自放線菌、大腸桿菌、釀酒酵母、梭菌等不同生物的不同酶基因組合由乙酰輔酶 A合成丁醇的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)其中特定組合的酶可產(chǎn)生最高水平的丁醇(2.5 mg/L)。雖然產(chǎn)量還非常低，但是這項(xiàng)研究體現(xiàn)了利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建細(xì)胞系統(tǒng)中優(yōu)化生物學(xué)元件的重要性。對(duì)長(zhǎng)鏈醇的代謝工程研究為合成生物學(xué)優(yōu)化也為搭建生物燃料代謝途徑的模塊優(yōu)化提供了很好的借鑒。美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校的James Liao研究組在大腸桿菌中引入了2-酮酸脫酸酶(KDCs)和乙醇脫氫酶ADH，從而可利用宿主菌氨基酸合成的中間產(chǎn)物2-酮酸生產(chǎn)多種長(zhǎng)鏈醇[38]。這項(xiàng)代謝工程研究的成功提示利用合成生物學(xué)手段建立新的代謝途徑的可行性。

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本地區(qū)番茄無公害栽培中，春季栽培采用蔬菜大棚栽培，大概在12月到第二年3月期間播種；播種期間，結(jié)合當(dāng)?shù)貧夂驐l件選擇播種時(shí)間，番茄開花期間避免高溫和雨季天氣。秋季番茄在8月份播種，也可以在6月份提前播種，以此來提升經(jīng)濟(jì)效益。番茄植株生長(zhǎng)期間，需要充足的水分，而番茄枝葉繁茂，蒸騰作用強(qiáng)，所以無論是莖葉還是果實(shí)都需要充足的水分，如果水分不足將影響果實(shí)膨大，嚴(yán)重情況下會(huì)降低番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。除了水分以外，養(yǎng)分的支持同樣十分關(guān)鍵，番茄是一種耐肥作物，所以生長(zhǎng)期間需要保證充足的肥料支持，實(shí)現(xiàn)氮、磷、鉀肥合理搭配。

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表3為不同上錐段底角壓降及分離效率對(duì)比。由表3可以看出，上錐段底角由55°減小到50°，壓降增加了6.21%，分離效率提高了1.87%；上錐段底角由50°減小到45°，壓降增加了3.22%，分離效率提高了7.57%；上錐段底角由45°減小到40°，壓降下降了18.88%，分離效率下降了11.94%，原因在于適當(dāng)?shù)臏p少上錐段底角有利于增大旋流器內(nèi)切向速度從而提高分離效率，不過過小的上錐段底角，反而會(huì)使中心錐結(jié)構(gòu)附近渦流增多，使其切向速度下降，降低了分離效率，說明上錐段底角在40°～50°間存在著一個(gè)最佳角度。

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Journals.im.ac.cn

Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for biofuel production

Xinqing Zhao1, Fengwu Bai1, and Yin Li2
1 School of Life Science and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China 2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Received:June 9, 2010;Accepted:June 13, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358), National Natural Science Foundation of China(No.30500011).

Corresponding author:Yin Li.Tel: +86-10-64807485; E-mail: yli@im.ac.cn國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA10Z358)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30500011)資助。