郭秀芳

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率占全身性腫瘤的 7%～10%,在女性僅次于子宮癌,已成為威脅女性健康的主要病因。本病的發(fā)病與遺傳有關(guān),絕經(jīng)期前后的女性發(fā)病率較高,是一種通過發(fā)生在乳腺上皮組織嚴(yán)重影響女性身心健康,甚至危及生命的最常見的一種惡性腫瘤之一[1]。由于乳腺的主要成分是脂肪,易造成石蠟切片的不完整性,我們探索自己實驗室的工作條件,及各種抗體的實驗條件來控制標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程,穩(wěn)定乳腺石蠟切片及其免疫組化染色的質(zhì)量報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 來自本院臨床近 2個月送檢的乳腺標(biāo)本,醫(yī)用可調(diào)控 16寸高壓鍋,2 000 kW電爐。

1.2 要試劑 PBS液(pH值 7.4),第一抗體為兔抗人雌激素受體(ER),兔抗人孕激素受體(PR),兔抗人CerbB-2單克隆抗體,第二抗體為快捷免疫組化Elivision試劑盒,DAB試劑盒,均購自福建邁新公司。

1.3 組織切片的制片 乳腺標(biāo)本經(jīng) 10%中性甲醛充分固定后,取其中病變組織,經(jīng)過梯度酒精充分脫水,二甲苯透明,58℃石蠟浸蠟,60℃石蠟包埋制成蠟塊,一次性刀片進(jìn)行切片,切片厚度為 2～3μm,40℃水溫展片,水中可加適量的乙醇,因其有張力,使切片能充分展開,無折皺,用經(jīng) APES防脫片處理過的載玻片撈片。65℃溫箱烤片 1～4h。

1.4 免疫組化染色方法 切片烤片后梯度酒精脫蠟至水,蒸餾水洗,PBS液浸泡 2 min×3次,3%的 H2O2溶液浸 5～10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS浸泡 2m in×3次,高壓鍋內(nèi)放 PBS液,加熱至沸騰,把切片置于耐高溫塑料切片架上放入鍋內(nèi),蓋上鍋蓋,扣上壓力閥,繼續(xù)加熱至噴氣,從噴氣開始計時 1～2m in,壓力鍋離開水源,冷卻至室溫,取出切片,我們用二步法使它不含生物素,可以避免由于生物素引起的非特異性背景染色,所以無需血清封閉內(nèi)源性生物素,將修復(fù)后的切片用 PBS液洗 2次之后,滴加一抗工作液 37℃ 1 h,PBS液洗 2次后滴加二抗 37℃ 15～20m in,PBS液洗 3次后,DAB顯色,復(fù)染,封片。

2 結(jié)果

乳腺組織切片無收縮開裂,組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài)清晰,乳腺癌細(xì)胞及各種炎癥細(xì)胞能清晰辨認(rèn),HE染色鮮艷,細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色,核仁呈紅色,對比度良好,免疫組化染色的結(jié)果為病變組織結(jié)構(gòu)完整,無脫片現(xiàn)象,陽性與陰性對比明顯,陽性物質(zhì)定位準(zhǔn)確,背景干凈清晰[2],無非特異性著色,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞輪廓完整清晰,染色結(jié)果穩(wěn)定可靠,敏感性高,特異性強(qiáng),ER、PR在乳腺組織切片中細(xì)胞核呈深褐色,CerbB-2在乳腺切片中細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞膜呈褐色,鏡下呈環(huán)狀表達(dá)。

3 討論

免疫組化由于其具有復(fù)雜性,在技術(shù)應(yīng)用過程中存在不少問題,直接或間接的影響了病理診斷,應(yīng)予以重視以下幾個方面,才能從總體上保證乳腺組織免疫組化染色的質(zhì)量。

3.1 制作優(yōu)質(zhì)的石蠟切片是做好乳腺癌免疫組化染色的基礎(chǔ),組織固定的好壞是制作免疫組化結(jié)果的關(guān)鍵因素。乙醇脫水盡可能從較低濃度起始,以免組織過度收縮常溫下二甲苯透明時間≤30min,不然組織變脆,制定嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行,否則是免疫組化產(chǎn)生假陽性[3]、假陰性或脫片的主要原因。

3.2 免疫組化切片的質(zhì)量控制要求,免疫組化染色使用的玻片必須用飽和的重鉻酸鉀濃硫酸浸泡 3 d以上,撈出后用水來水徹底清洗干凈,再用 95%的乙醇過一遍,晾干后涂防脫片劑烘干備用,裱片時切片片膜不能留有氣泡,烤片時溫度過低、時間過短,則易脫片,溫度過高、時間過長則對抗原有破壞,烤片后專用二甲苯、乙醇脫蠟至水洗,脫蠟要徹底。我們曾采用水浴法等方法進(jìn)行抗原修復(fù),但效果不如高溫高壓抗原修復(fù)法理想[4]。另外高溫高壓加熱時間的長短很重要,從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在3min內(nèi),時間過長,可能會使染色背景加深。PBS緩沖液不能重復(fù)使用,且容量必須保證所有切片都能浸泡到,整個染色過程不要讓切片干涸。顯色在鏡下控制,時間約 3～7min,在陽性明確的部位著黃色即終止顯色,此時顯色程度較佳,能有效地避免背景著色。蘇木素復(fù)染后要充分返藍(lán),否則背景呈紫紅色。

3.3 增強(qiáng)特異性著色、降低非特異性染色是免疫組化的質(zhì)量保證,抗體是免疫組織化學(xué)最核心的試劑,其質(zhì)量直接影響免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷繼而影響診斷,由于乳腺癌組織中的淋巴細(xì)胞、脂肪細(xì)胞會產(chǎn)生非特異性染色,因此要選擇特異性強(qiáng),效價高的一抗,新購進(jìn)的抗體儲存在 4℃冰箱并進(jìn)行預(yù)實驗,摸索出最佳實驗條件?？贵w最好購即用型,以免在稀釋過程中增加不必要的錯誤。防止失效的抗體進(jìn)入實驗室,此外要選擇病變典型的做免疫組化染色對照,一定要每一批免疫組化均設(shè)有已知陽性對照和用 PBS代替一抗的空白對照。

3.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判讀,結(jié)果的判斷免疫組化切片應(yīng)是陽性標(biāo)記強(qiáng)而非特異性染色淡或無,兩者形成鮮明的對比,陽性表達(dá)必須在細(xì)胞或組織特定的部位,細(xì)胞邊界清楚;每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結(jié)果作出正確判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比或陽性細(xì)胞的染色深度來判斷,其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應(yīng)分布總是有規(guī)律、局限、定位準(zhǔn)確和一定形態(tài)特征的,如細(xì)胞膜著色呈圓形;典型的細(xì)胞核著色為均質(zhì)狀,核仁和染色質(zhì)呈顆粒狀著色。

3.5 免疫組織化學(xué)陽性庫的建立。為了保證陽性對照的可靠性,在日常工作中要收集各種抗原的陽性組織和陽性切片,逐步建立陽性對照切片庫及相應(yīng)的電子檔案庫。如預(yù)期結(jié)果為陰性或病理形態(tài)診斷與免疫組化結(jié)果相反時,必須要有陽性對照才能作出正確的病理診斷,陽性對照能說明染色技術(shù)和陰性結(jié)果的可靠性,不是由于標(biāo)本處理不當(dāng)導(dǎo)致的抗原喪失、方法錯誤、技術(shù)不熟練等造成的假陰性。乳腺組織免疫組化染色步驟多、過程長、影響因素也多,因此只有在各個細(xì)節(jié)都認(rèn)真對待,然后以常規(guī)的形式相對固定下來,才能確保其免疫組織化學(xué)結(jié)果的可靠性。

1 周麗梅,張斌.乳腺癌癌周浸潤的病理組織學(xué)觀察.臨床外科雜志,2002,10：244.

2 張銘,司少艷,韓瑞剛,等.免疫組化 SP法與 PicTureTM兩步法的比較.診斷病理學(xué)雜志,2004,11：58-59.

3 李向紅.醫(yī)學(xué)實驗室標(biāo)準(zhǔn)化的方向.中華病理學(xué)雜志,2004,33：591-592

4 王力,楊舉倫.高壓鍋水浴法修復(fù)組織抗原防脫片技術(shù)的應(yīng)用.診斷病理學(xué)雜志,2002,9：161.