王健,劉榮堂,張?zhí)N薇,曹靜娟

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所,北京 100094）

衛(wèi)星搭載的植物可產(chǎn)生形態(tài)學(xué)、物候期、細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子水平等一系列的變異[1]。植物材料在特殊的空間條件下,經(jīng)受強(qiáng)輻射、微重力、高真空等太空誘變因子的復(fù)合作用,發(fā)生遺傳性狀變異[2]。如小麥（Triticum aestivum）出現(xiàn)超綠突變體植株[3],黃瓜（Cucumis sativus）子葉有不同展開度的變異[4],草地早熟禾（Poa pratensis）平均葉片數(shù)增加[5],狗牙根（Cynodon dactylon）植株的節(jié)間長度變長[6]。除此以外,對(duì)空間搭載植物進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn),龍牧803苜蓿（Medicago sativa）M2代的葉綠素含量明顯減少[7]。李社榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)空間搭載的玉米（Zea mays）后代葉片細(xì)胞壁薄厚凹凸不平,細(xì)胞大小不等,表面不規(guī)則,部分細(xì)胞退化消失,僅殘留細(xì)胞壁,細(xì)胞液泡化程度加劇,將細(xì)胞器擠至四周,并導(dǎo)致葉綠體變形等。本研究以草坪用白三葉（Tri folium repens）為對(duì)象,分析衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉M1代葉綠素含量、光合特性以及細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響,旨為草坪草空間育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料供試材料為瑞文德白三葉。精選后的種子分為2份:一份作地面對(duì)照（CK）,另一份用于衛(wèi)星搭載（SP）。搭載的“實(shí)踐八號(hào)”育種衛(wèi)星,于2006年9月9日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心升空,衛(wèi)星在近地點(diǎn)187 km、遠(yuǎn)地點(diǎn) 463 km的近地軌道運(yùn)行,于9月 24日返回地面。另一部分,貯存于地面溫濕度相近（20℃左右）的環(huán)境中。

2009年3月隨機(jī)選取部分種子,在溫室用育苗盤育苗,5月10日移栽到花盆中。

1.2 葉綠素的測(cè)定稱取剪碎處理的和對(duì)照白三葉新鮮葉片各0.2 g,轉(zhuǎn)入25 mL棕色容量瓶中,再加入80%的丙酮定容至刻度。將其放入暗室中浸提（浸提過程中搖動(dòng)2～3次）24 h后,把葉綠體色素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內(nèi),以80%丙酮為空白對(duì)照,在721型分光光度計(jì)上分別以663、646 nm 波長進(jìn)行比色,以原提取液為空白溶液,重復(fù)3次。按公式計(jì)算葉綠素a、b含量[9]。

式中,V表示浸提液總體積（mL）,W表示樣品質(zhì)量（g）。

1.3 光合特性測(cè)定2008年10月1日（晴天）采用便攜式光合作用分析儀（LI-6400,美國CID公司）在開路系統(tǒng)下測(cè)定各植株瞬時(shí)凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Cond）、蒸騰速率（Tr）以及胞間CO2濃度（Ci）。對(duì)照和處理各選擇5個(gè)植株,測(cè)定向陽面成熟葉片,分4個(gè)時(shí)間段:9:00-11:00,11:00-13:00,13:00-15:00,15:00-17:00。計(jì)算水分利用效率（WUE=Pn/Tr）[10]。

1.4 葉面積測(cè)定在測(cè)定光合特性之前,隨機(jī)選取處理和對(duì)照各5株,每一株隨機(jī)選取3個(gè)葉柄上的葉片,用掃描式活體葉面積儀（SHY-150,哈爾濱光學(xué)儀器廠）測(cè)定,并標(biāo)記測(cè)定的葉片。

1.5 超微結(jié)構(gòu)分別剪取處理和對(duì)照相同部位的葉片,切成1 mm2小塊,置于用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）配制的2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行前固定,用1%鋨酸后固定。經(jīng)0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗 30%、50%、70%、80%和90%丙酮系列脫水后,用環(huán)氧樹脂SPURR包埋、聚合。采用切片機(jī)（LKB-V,德國徠卡公司）超薄切片,染色,再用（JEM-1230,日本JEOL公司）透射電鏡,80 kV加速電壓下觀察并照相[11]。

1.6 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和對(duì)照?qǐng)D形繪制采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉葉片葉綠素的影響

衛(wèi)星搭載處理對(duì)葉綠素a、葉綠素總量有影響,表現(xiàn)出負(fù)向變異,即地面對(duì)照高于搭載組,衛(wèi)星搭載白三葉當(dāng)代植株葉片的葉綠素a和葉綠素總量顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。而對(duì)于葉綠素b,衛(wèi)星搭載處理和對(duì)照二者間差異不顯著（P＞0.05）；衛(wèi)星搭載處理葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量的變異程度始終大于對(duì)照。

2.2 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉植株光合特性的影響在早上9:00-11:00,處理的胞間CO2濃度差異顯著低于對(duì)照（P＜0.05）,在13:00-15:00,凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。水分利用率（WUE）對(duì)照與搭載組間在各個(gè)時(shí)間段水平均差異不顯著（P＞0.05）（圖1-5）。

圖1 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉凈光合速率日變化的影響

圖2 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉氣孔導(dǎo)度日變化的影響

圖3 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉蒸騰速率日變化的影響

圖4 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉胞間CO2濃度日變化的影響

圖5 衛(wèi)星搭載對(duì)水分利用率日變化的影響

處理和對(duì)照的凈光合速率在9:00-11:00最高,而后一直呈下降趨勢(shì)。但在11:00-13:00、13:00-15:00,下降趨勢(shì)出現(xiàn)延緩現(xiàn)象。而處理和對(duì)照的氣孔導(dǎo)度在9:00-11:00最大,對(duì)照的蒸騰速率在13:00-15:00最大,在11:00-13:00氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率同步下降,但 13:00-15:00,氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率又略微上升。處理和對(duì)照的胞間CO2濃度在9:00-11:00最低,而后迅速上升,在13:00-15:00間達(dá)到最高。處理和對(duì)照的水分利用率與胞間 CO2濃度相反,在9:00-11:00最高,然后也是迅速下降,到下午13:00-15:00下降到最低點(diǎn),然后開始上升。從圖1-3可以明顯看到,在1天中的4個(gè)時(shí)間段,凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率,處理均比對(duì)照低。

2.3 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉植株的超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照與搭載組的白三葉葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)差異比較明顯,對(duì)照白三葉的細(xì)胞壁比較均勻,葉綠體也比較均勻的分布在整個(gè)細(xì)胞中（圖6a）,淀粉顆粒大,而且比較飽滿,較均勻的分布在各個(gè)葉綠體中,數(shù)量比較少（圖6c）。線粒體比較完整（圖6e）。基粒片層排列整齊,且貫穿整個(gè)葉綠體（圖6g）。嗜鋨顆粒比較少,且大多數(shù)集結(jié)在葉綠體中央（圖6i）。

衛(wèi)星搭載組白三葉葉片的細(xì)胞,有的細(xì)胞壁呈不規(guī)則的增厚,扭曲,葉綠體大小不等,有的向細(xì)胞中央集中,葉綠體膜有的被撕裂（圖6b）。淀粉粒多,且大小不一,有的無序堆積在整個(gè)葉綠體中（圖6d）。線粒體相對(duì)完整,但有的線粒體有明顯的破裂,內(nèi)含物流出,出現(xiàn)空洞、溢裂的現(xiàn)象（圖6f）?；Ｆ瑢拥膶訑?shù)減少,直徑卻很大（圖6h）。推測(cè)與葉綠體的性狀扭曲有關(guān)。嗜鋨顆粒在葉綠體中有很大的不同,有的嗜鋨顆粒只分布在葉綠體的兩側(cè),且數(shù)量極少（圖6j）,而大多數(shù)葉綠體中的嗜鋨顆粒比較多,而且比較平均的分布在整個(gè)葉綠體中（圖6k）。

3 討論與結(jié)論

3.1 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉葉綠素的影響航天誘變能對(duì)白三葉光合特性及葉綠素的含量產(chǎn)生影響。有研究[12]發(fā)現(xiàn),草地早熟禾經(jīng)空間誘變后,3個(gè)變異株系葉片光合特性及葉綠素的含量及葉綠素a/b均發(fā)生改變,從而影響其對(duì)光能的利用效率、固定CO2的能力和對(duì)不同光質(zhì)的利用效率?？臻g條件引起葉綠素的損傷,或者負(fù)向變異較多。主要原因可能是處理引起葉綠素相關(guān)酶受到抑制,以及中間產(chǎn)物合成的減少；或者處理引起葉綠素酶作用增強(qiáng),導(dǎo)致葉綠素的分解加快[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),處理葉綠素總量相對(duì)于對(duì)照顯著下降,其中主要是葉綠素a下降顯著。處理葉綠素b相對(duì)于對(duì)照含量下降,但差異不顯著。葉綠素a產(chǎn)生的熒光遠(yuǎn)大于葉綠素b,而這與光能的吸收,轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān)[15]。因此,處理一定程度影響了白三葉的光合作用。

圖6 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉植株的超微結(jié)構(gòu)的影響

3.2 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉光合特性的影響航天誘變能對(duì)白三葉光合特性及葉綠素的含量產(chǎn)生影響。假儉草（Eremochloa ophiuroides）和細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia japonica）的光合日變化曲線呈雙峰型,有“午休”發(fā)生[16]。而 Hodges[17]通過研究也發(fā)現(xiàn),由于中午日光輻射強(qiáng)烈,環(huán)境相對(duì)濕度和CO2含量降低,導(dǎo)致植物光合作用受抑制,凈光合速率的日變化曲線會(huì)有一個(gè)明顯的光合午休現(xiàn)象；韓建秋[18]研究發(fā)現(xiàn),土壤相對(duì)含水量為25%時(shí),白三葉凈光合速率和蒸騰速率下降明顯,日變化曲線表現(xiàn)為單峰特征,氣孔導(dǎo)度顯著降低,而胞間CO2濃度升高,非氣孔限制成為Pn下降的主要原因。這與韓烈保等[19]的研究結(jié)果一致。本研究中,13:00-15:00,處理的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率顯著低于對(duì)照,處理和對(duì)照的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率都不呈明顯的雙峰型,凈光合速率處理和對(duì)照則一直都呈單峰下降的趨勢(shì)。這可能是由于在溫室中培養(yǎng),溫室的溫度過高,引起白三葉土壤水分蒸發(fā)過快,從而引起了“干旱脅迫”,造成凈光合速率下降。許大全[20]認(rèn)為,引起葉片光合速率降低的植物自身因素?zé)o外乎氣孔關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合活性的下降兩類,前者使胞間CO2濃度降低,后者使胞間CO2濃度增高。當(dāng)2種因素同時(shí)存在時(shí),胞間CO2濃度變化的方向依賴于占優(yōu)勢(shì)的那個(gè)因素。也就是說,當(dāng)氣孔的部分關(guān)閉是葉片光合速率降低的主要原因時(shí),胞間CO2濃度降低；而當(dāng)葉肉細(xì)胞光合活性降低是葉片光合速率降低的主要原因時(shí),胞間CO2濃度增高。因此,考慮到上述可能的復(fù)雜情況,判斷哪一個(gè)因素占優(yōu)勢(shì),標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)是胞間CO2濃度變化的方向。本研究發(fā)現(xiàn),處理和對(duì)照凈光合速率一直在下降,而處理和對(duì)照的胞間CO2濃度則不斷上升,說明處理和對(duì)照的葉肉細(xì)胞光合活性下降,而葉肉細(xì)胞光合活性的下降促使凈光合速率的下降。在整體上,處理比對(duì)照的下降明顯,尤其在13:00-15:00,處理的凈光合速率顯著下降。這可能與處理白三葉的葉綠素a和葉綠素總量顯著下降有關(guān)。

3.3 衛(wèi)星搭載對(duì)白三葉超微結(jié)構(gòu)的影響空間誘變的紅豆草（Onobrychis viciaef olia）葉片的細(xì)胞壁不規(guī)則的加厚,細(xì)胞質(zhì)稀薄,液泡大,葉綠體變小,形狀多為不規(guī)則,葉綠體內(nèi)的淀粉顆粒細(xì)小,但數(shù)量明顯多于對(duì)照,匍匐型突變體表現(xiàn)尤為明顯[21]。衛(wèi)星搭載后苜蓿細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的變化,搭載組細(xì)胞葉綠體扭曲,向細(xì)胞中央集中,膜膨散,基粒數(shù)目增多,基粒直徑增加,片層數(shù)減少,葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒數(shù)目增加,體積變大,線粒體內(nèi)外膜膨大或破裂,內(nèi)含物流出,嵴消失,出現(xiàn)空洞、溢裂現(xiàn)象,葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)量增多,體積變大,海綿細(xì)胞細(xì)胞壁明顯加厚；個(gè)別海綿細(xì)胞,淀粉粒幾乎占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞,數(shù)目多,體積大[22]。本研究中,細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器大多為負(fù)向變異,或遭受一定程度的損傷。姚允聰?shù)萚23]發(fā)現(xiàn)弱光條件下桃（Prunus persica）葉片葉綠體的基粒數(shù)與基粒片層數(shù)的增加,可能使附著在基粒片層上的補(bǔ)光色素和光合酶增多,有利于光能在類囊體上的傳播。但是本研究發(fā)現(xiàn)光合效率下降,原因很可能是衛(wèi)星搭載白三葉葉片細(xì)胞中的葉綠體粒片層減少,從而使得嗜鋨顆粒在葉綠體中分布不集中,這可能造成了補(bǔ)光色素和光合酶的減少,從而不利于光能的傳遞。

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