李瑩瑩，吳彩娥,*，楊劍婷，賈韶千，徐文斌，彭方仁

(1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

白果蛋白質(zhì)提取及SDS-PAGE分析

李瑩瑩1，吳彩娥1,*，楊劍婷2，賈韶千1，徐文斌1，彭方仁1

(1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

以白果為原料，采用不同的原料處理及蛋白質(zhì)提取方法，運(yùn)用單因素和正交設(shè)計的方法，以料液比、提取時間、提取液濃度、提取液pH值為考察因素，研究白果蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件，并對提取的白果蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果表明：經(jīng)過冷凍干燥處理的白果采用Tris-HCl提取法獲得的白果蛋白含量較高；Tris-HCl法提取白果蛋白的最佳工藝為pH8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液、料液比1:20(g/mL)、提取時間4h，白果蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到75.01%。白果蛋白SDS-PAGE分析表明，白果蛋白中約含13條亞基，主要為21kD和32kD的兩種亞基，白果蛋白的亞基主要集中在31～100kD，占亞基總數(shù)的77%。

白果；蛋白質(zhì)；提??；SDS-PAGE

銀杏為裸子植物門銀杏綱銀杏植物(Gingko biloba L.)，為一科一屬一種的特殊植物，是我國特有的古老珍貴樹種之一[1]。銀杏種實(shí)去掉肉質(zhì)外種皮后的種核部分俗稱白果。白果富含淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，以及銀杏酸、白果酚、五碳多糖、膽固醇等功能成分[2]，自古以來被當(dāng)作養(yǎng)生延年的上品，而現(xiàn)代已成為傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品。初步研究顯示，白果具有高效廣譜殺菌作用和耐缺氧、抗疲勞、延緩衰老等保健治療功效[3]。白果中含有8.7%～13.4%的蛋白質(zhì)(不同品種有差異)，其氨基酸組成豐富、合理，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白，有研究顯示，白果藥食兼?zhèn)涞奶匦约捌浔＝」δ芘c其蛋白質(zhì)成分有著緊密聯(lián)系，但現(xiàn)今對白果蛋白質(zhì)的研究較少，且尚處于初始階段。Jensen等[4]在1989年從白果中分離出一種類似豆球蛋白的物質(zhì)。黃文等[5]在2004年采用鹽溶法提取白果中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了抗生物氧化動物實(shí)驗(yàn)，表明白果蛋白具有體外抗氧化作用和抗生物氧化的作用。除此之外，楊劍婷等[6]研究認(rèn)為白果中的貯藏蛋白可能具有致敏性，從而影響白果的加工利用，可見對白果蛋白質(zhì)的研究，對白果的有效利用有著重要的意義。

SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)在蛋白質(zhì)的量化、比較及特性鑒定中是一種經(jīng)濟(jì)、快速、重復(fù)性好的方法。本實(shí)驗(yàn)以白果為原料，對白果

蛋白質(zhì)的提取方法及工藝條件進(jìn)行研究，并運(yùn)用SDSPAGE法對白果蛋白進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上建立適宜白果蛋白提取和SDS-PAGE的一套方法，以期為白果的品種純度檢測和加工利用等研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白果：品種為泰興大佛指，購自江蘇泰興市。白果去掉外種皮后于0～4℃貯藏。

SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑 Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800PC紫外分光光度計 北京普析通用容器有限責(zé)任公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；電泳自動成像儀 美國BIO-RAD生化科技有限公司；PHS-2C型數(shù)顯pH計 上海智光儀器儀表有限公司；GL-20GII型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 原料處理及蛋白質(zhì)提取

1.3.1 原料處理

凍干處理：新鮮白果于－20℃真空冷凍干燥，研磨過篩，石油醚脫脂；烘干處理：新鮮白果于30℃烘箱中烘烤12h，研磨過篩，石油醚脫脂；對照：去掉外種皮后于0～4℃貯藏的白果。

1.3.2 白果蛋白質(zhì)提取

1.3.2.1 Tris-HCl法

參照谷瑞升等[7]的方法。取脫脂后3種樣品各1g，加入10mL的0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，4℃浸提6h后于4℃、4000r/min離心15min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 鹽溶法

參照黃文等[5]的方法。取脫脂后3種樣品各1g，加入10mL的0.14mol/L NaCl溶液，4℃浸提6h后在4℃、4000r/min離心15min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.3 磷酸緩沖液提取法

取脫脂后3種樣品各1g，加入10mL的0.05mol/L pH8.0磷酸緩沖液(含0.1mol/L KCl、2mmol/L EDTA)，4℃浸提6h后4℃、4000r/min離心15min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.4 三氯乙酸(TCA)-丙酮提取法

參照Damerval等[8]的方法。取脫脂后3種樣品各1g，加入預(yù)冷的2mL三氯乙酸(TCA)-丙酮溶液(含體積分?jǐn)?shù)10% TCA、0.07%β-巰基乙醇)，充分混勻后，在－20℃靜置1h，4℃、15000r/min條件下離心15min。離心后去掉上清液，保留的沉淀用預(yù)冷的丙酮(－20℃，含0.07%β-巰基乙醇)懸浮，在－20℃冰箱內(nèi)浸提過夜。次日，在4℃、15000r/min條件下離心10min，去上提液，留沉淀，再加入經(jīng)預(yù)冷的丙酮進(jìn)行浸提，1h后相同條件離心，棄上清液，收集沉淀。沉淀在30℃恒溫烘箱中烘干。取干粉，按1:10(g/mL)加入蒸餾水溶解，溶解后以4000r/min離心15 min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量。

1.4 白果蛋白質(zhì)提取工藝的確定

1.4.1 單因素試驗(yàn)

在其他條件一定時，提取液濃度采用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mol/L Tris-HCl 5個水平，提取液pH值采用6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 Tris-HCl(0.2mol/L) 6個水平，料液比采用1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)6個水平，提取時間采用2、4、6、8、10h 5個水平，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取液濃度、提取液pH值、料液比、提取時間進(jìn)行四因素四水平L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計。

1.5 蛋白質(zhì)的測定

可溶性蛋白含量應(yīng)用Bradford法[9]，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250染色，做標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.2134X+0.0214，R2=0.9985。

提取材料中蛋白質(zhì)含量：微量凱氏定氮法[10]。

1.6 SDS-PAGE凝膠電泳

采用電泳儀進(jìn)行不連續(xù)雙垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳。將白果蛋白提取液與樣品緩沖液(pH6.8、0.5mol/L Tris-HCl緩沖液2.0mL、無水丙三醇2.0mL、20% SDS 2.0mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍(lán)0.5mL、β-巰基乙醇1.0mL、去離子水2.5mL)按1:1的體積比例混合，100℃煮沸5min，離心，上樣20μL，分離膠質(zhì)量濃度12mg/100mL，濃縮膠質(zhì)量濃度3.9mg/100mL。開始電流10mA，進(jìn)入分離膠后20mA，電泳時間2.5～3.5h?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色，過夜，放入脫色液中脫色，直至膠片背景藍(lán)色完全透明狀，電泳自動成像儀拍照，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量運(yùn)用Quality one軟件進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS(Version 3.01)統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，設(shè)置顯著水平分別為P＜0.05及P＜0.01。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均為平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并進(jìn)行方差分析和Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料處理及蛋白質(zhì)提取方法的確定

對于不同處理的白果用4種提取方法獲得的白果蛋白質(zhì)的含量，如圖1所示。原料白果中總蛋白含量經(jīng)凱氏定氮法測定為10.82g/100g干質(zhì)量。由圖1可知，對于凍干處理的白果原料，4種提取方法得到的白果蛋白質(zhì)的含量相差較大，以Tris-HCl法得到的蛋白質(zhì)的含量最高，達(dá)到5.82mg/mL，其次是TCA-丙酮提取法、磷酸緩沖液提取法、鹽溶法。經(jīng)多重比較，4種提取方法得到的蛋白質(zhì)含量之間差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。對于新鮮白果及烘干處理的白果，Tris-HCl法得到的蛋白質(zhì)的含量也略高于其他3種提取液，且差異顯著(P＜0.05)。所以本實(shí)驗(yàn)采用Tris-HCl法為白果蛋白的提取方法。從圖1可以看出，對于Tris-HCl法提取的3種處理白果的蛋白質(zhì)含量，經(jīng)多重比較，凍干處理的白果經(jīng)過提取獲得的蛋白質(zhì)的含量顯著高于烘干處理及新鮮白果(P＜0.01)，可能原因是冷凍干燥在低溫、低壓下進(jìn)行，物料的干燥在凍結(jié)狀態(tài)下完成，與其他干燥方法相比，物料的物理結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)變化極小，且其內(nèi)部形成多孔的海綿狀[11]，有利于蛋白質(zhì)的溶出。

圖1 原料處理方式及不同提取方法對白果蛋白質(zhì)的含量的影響Fig.1 Effects of material pretreatment ways and extraction solvents on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取液濃度對提取率的影響

圖2 提取液濃度對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of Tris-HCl concentration on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

由圖2可見，在Tris-HCl濃度為0.05～0.15mol/L的范圍內(nèi)，隨著Tris-HCl濃度的提高，蛋白質(zhì)提取率不斷升高，當(dāng)Tris-HCl濃度為0.15白果蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最高。當(dāng)提取液濃度再逐漸增加時，蛋白質(zhì)提取率不斷下降?？赡苁菨舛冗M(jìn)一步提高時，離子的水合作用，降低了蛋白質(zhì)的溶解度[12]，從提高蛋白質(zhì)提取率及節(jié)約溶質(zhì)用量兩方面考慮，選擇0.15mol/L的Tris-HCl溶液為白果蛋白質(zhì)的提取液。

2.2.2 提取液pH值對提取率的影響

當(dāng)提取液pH值由6.5逐步升高到9.0時，白果蛋白質(zhì)提取率隨pH值的增高增大(圖3)，此規(guī)律在pH值7.0～8.5之間更為明顯。但當(dāng)pH值繼續(xù)增加時，提取率增加減慢，這是由于堿可以使白果的結(jié)構(gòu)變疏松，還會打破蛋白質(zhì)分子間的部分氫鍵[13]，從而促使淀粉和蛋白質(zhì)分離，增加了蛋白提取率。但是，過強(qiáng)的堿性環(huán)境，會使蛋白質(zhì)變性和水解，增加美拉德反應(yīng)程度，使蛋白質(zhì)顏色變黑，商用品質(zhì)降低；強(qiáng)堿還易引起賴氨酸等發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，所以，提取白果蛋白質(zhì)的提取液pH值應(yīng)控制在8.5左右。

圖3 提取液pH值對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

2.2.3 料液比對提取率的影響

圖4 料液比對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

隨著溶液體積的增大，原料與提取液接觸面的增大，蛋白質(zhì)越容易滲透到提取液中，提取率相應(yīng)增大[14]。從圖4看出，當(dāng)提取液的料液比在1:10～1:20(g/mL)

之間時，白果蛋白質(zhì)的提取率不斷升高，料液比達(dá)到1:20(g/mL)時提取率最高，之后，提取率基本趨于穩(wěn)定，略有下降，考慮到食品工業(yè)生產(chǎn)過程中，溶液體積太大會增加水分和溶劑的用量，也增大后續(xù)干燥處理的負(fù)擔(dān)，提高了產(chǎn)品成本，故認(rèn)為選取料液比1:20(g/mL)進(jìn)行提取比較適宜。

2.2.4 提取時間對提取率的影響

圖5 提取時間對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

從圖5可看出，提取時間在4h時，蛋白質(zhì)提取率較高，其后隨著提取時間的進(jìn)一步增加，蛋白質(zhì)提取率下降，但下降幅度不大，在4h到10h的區(qū)間內(nèi)，提取率從58.6%下降到54.2%，下降比率為7.3%，可能的原因是白果粉本身需要一定的溶脹時間，充足的溶脹時間利于蛋白質(zhì)的分離溶解[15]，但若提取時間過長，則可能有部分蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚沉淀，與不溶物質(zhì)一起在離心時除去了，而且時間加長也會加大生產(chǎn)成本，所以綜合各方面因素，認(rèn)為浸提時間選4～6h比較合適。

2.3 白果蛋白質(zhì)提取條件優(yōu)化

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上做正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

選取料液比(A)、提取時間(B)提取液濃度(C)、提取液pH值(D)4個因素，以白果蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，優(yōu)化出白果蛋白質(zhì)的最佳提取條件，從試驗(yàn)結(jié)果(表1)可以得出：影響白果蛋白質(zhì)子蛋白質(zhì)提取率的因素顯著(R值)次序?yàn)锳＞C＞D＞B，即料液比對白果蛋白質(zhì)的提取率影響最大。極差分析表明白果蛋白質(zhì)的最佳提取條件應(yīng)為A3B2C2D4，即料液比1:20(g/mL)、提取時間4h、pH8.5、0.15mol/L的Tris-HCl為白果蛋白的提取條件為最優(yōu)組合。本研究以此條件作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到樣品蛋白質(zhì)提取率為75.01%。正交試驗(yàn)中組合A3B1C3D4的蛋白質(zhì)提取率為最大值為70.90%。因此，pH8.5、0.15mol/L的Tris-HCl溶液作為提取液、料液比1:20(g/mL)、提取時間4h為白果蛋白質(zhì)的最佳提取條件。所得白果蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到75.01%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table2 Variance analysis for protein yield with various extraction conditions

表2方差分析結(jié)果表明：料液比為影響白果蛋白質(zhì)提取過程的顯著因素，提取時間、提取液濃度、提取液pH值為不顯著因素。

2.4 白果蛋白質(zhì)亞基分布及其分子質(zhì)量

圖6 白果蛋白的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of proteins from Ginkgo biloba seeds

對白果蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，白果蛋白的亞基分布見圖6，染色后白果蛋白質(zhì)條帶清晰可見，染色程度越深，說明含量越高，反之越低[16]。從白果蛋白的SDS-PAGE圖及其亞基分布譜圖可以看出，白果蛋白所含亞基數(shù)約為13條，亞基的分子質(zhì)量范圍為

10～100kD，其中，白果蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為99.2kD，最小的為13.1kD；亞基10、亞基11含量最高，其次為亞基7、亞基9及亞基12。白果蛋白的亞基主要集中在31～100kD之間，占亞基總數(shù)的77%，其余亞基集中在13～22kD的范圍內(nèi)，可見白果蛋白多以大分子的結(jié)構(gòu)存在。綜上所述，白果蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后得到了很好的分離效果，蛋白質(zhì)帶表現(xiàn)出了良好的多態(tài)性。白果中蛋白種類豐富，主要存在分子質(zhì)量為21kD和32kD的兩種亞基，十余種含量略低的其他蛋白亞基，大分子亞基較多。

3 結(jié) 論

經(jīng)過冷凍干燥處理的白果采用Tris-HCl提取法獲得的白果蛋白含量較高，顯著優(yōu)于其他處理。通過單因素及正交試驗(yàn)，經(jīng)方差分析可知在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對白果蛋白質(zhì)提取率作用大小依次為：料液比＞提取液濃度>提取液pH＞提取時間。Tris-HCl法提取白果蛋白的最佳工藝為pH8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液、料液比1:20(g/mL)、提取時間4h，白果蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到75.01%。采用Tris-HCl提取法提取的白果蛋白經(jīng)SDSPAGE分析，得到了很好的分離效果，條帶清楚，背景清晰。Tris-HCl提取法適于白果蛋白的SDS-PACE分析。白果蛋白中約含13條亞基，主要為21kD和32kD的兩種亞基，白果蛋白的亞基主要集中在31～100kD之間，占亞基總數(shù)的77%。

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Extraction and SDS-PAGE Analysis of Proteins from Ginkgo biloba Seed

LI Ying-ying1，WU Cai-e1,*，YANG Jian-ting2，JIA Shao-qian1，XU Wen-bin1，PENG Fang-ren1
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China；2. College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

A comparative investigation of the effects of material pretreatment ways and extraction solvents on protein extraction from Ginkgo biloba seeds was made, and based on the experimental results Tris-HCl as the optimal extraction solvent and lyophilization as the optimal material pretreatment way were selected for the subsequent investigations, including optimization of protein extraction from Ginkgo biloba seeds by single-factor and orthogonal array design methods and SDS-PAGE analysis of the proteins extracted from Ginkgo biloba seeds. The optimal conditions for extracting proteins from this material were determined to be: pH, 8.5; Tris-HCl concentration, 0.15 mol/L; material/liquid ratio, 1:20; and extraction duration, 4 h. A protein yield of 75.01% was obtained under the optimal extraction conditions. The SDS-PAGE analysis showed that the proteins from Ginkgo biloba seeds contained approximately 13 subunits (mainly 21 kD and 32 kD ones) and that majority of them had a molecular mass varying from 31 to 100 kD, with a relative content of 77%.

Ginkgo biloba seed；protein；extraction；SDS-PAGE

S664.3；TS201.2

A

1002-6630(2010)22-0036-05

2010-01-18

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(200802980004；20070298008)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30872055)

李瑩瑩(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)植物資源加工利用及其安全控制。E-mail：njliyingying@yahoo.com.cn

*通信作者：吳彩娥(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭こ碳夹g(shù)及食品活性物質(zhì)分離純化。E-mail：sxwucaie@163.com