高 博，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

耦合Plastein反應(yīng)的大豆蛋白降壓肽酶法制備技術(shù)

高 博，趙新淮*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

利用堿性蛋白酶酶解大豆分離蛋白，制備出水解度為16.6%的大豆蛋白水解物，隨后對水解物進行Plastein反應(yīng)修飾。利用響應(yīng)面分析優(yōu)化修飾反應(yīng)條件，得到適宜參數(shù)：底物質(zhì)量分數(shù)45%、酶添加量275U/g蛋白質(zhì)、反應(yīng)時間3～4h、溫度30℃。制備修飾反應(yīng)程度不同的9種修飾產(chǎn)物并評價其體外ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)修飾產(chǎn)物的IC50值為0.64～1.30mg/mL，均小于大豆蛋白水解物IC50值(1.45mg/mL)。排阻色譜分析結(jié)果確認，修飾產(chǎn)物中有更多的高分子質(zhì)量肽段存在。結(jié)果顯示，大豆蛋白的酶解以及耦合Plastein反應(yīng)修飾，是一種制備高ACE抑制活性大豆蛋白降壓肽的新技術(shù)。

大豆蛋白水解物；Plastein反應(yīng)；ACE抑制活性；堿性蛋白酶；排阻色譜

Abstract：Soybean protein hydrolysates (SPHs) with a degree of hydrolysis of 16.6% were prepared by 4 h hydrolysis with alcalase, and then subjected to plastein reaction for modification. Response surface analysis was applied to optimize the conditions for plastein reaction, and the optimal conditions obtained were as following:substrate concentration 45%, enzyme loading 275 U/g proteins, reaction time 3 to 4 h and reaction temperature 30 ℃. Nine modified products were prepared, and their ACE inhibitory activities were evaluatedin vitro. It was found that the IC50 values of the modified products were in the range of 0.64 to 1.30 mg/mL, lower than that of SPHs (1.45 mg/mL). The analytical results from size exclusion chromatography confirmed that more large peptides with higher molecular weight were generated in the modified products. This study suggests that enzymatic hydrolysis coupled with plastein reaction might be served as a new approach to prepare ACE inhibitory peptides with higher activity from soybean protein isolate.

Key words：soybean protein hydrolysates；plastein reaction；ACE inhibitory activity；alcalase；size exclusion chromatography

高血壓是導(dǎo)致成年人健康問題的多發(fā)病。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)使人體正常的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡而引起血壓升高。常用的ACE抑制劑，如人工合成的卡托普利、恩那普利、阿拉普利等已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于高血壓臨床醫(yī)療[1]，但是它們有咳嗽、味覺障礙和皮疹等副作用[2]。利用蛋白質(zhì)的酶解獲得具有ACE抑制活性的蛋白質(zhì)水解物——降壓肽，為食品科學(xué)家和營養(yǎng)學(xué)家所重視。

Plastein反應(yīng)是一種肽鏈延長反應(yīng)，反應(yīng)過程中，由較低分子質(zhì)量的肽形成較高分子質(zhì)量、類似于蛋白質(zhì)的混合物，稱為Plastein(類蛋白)[3]，反應(yīng)機制有3種：縮合作用[4]、轉(zhuǎn)肽作用[5]和物理聚集[6]?？梢灶A(yù)料，蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解以后，水解物再耦合進行Plastein反應(yīng)，如果發(fā)生縮合作用和轉(zhuǎn)肽作用，就會形成原水解物中不存在的新肽段，就有可能改變其生物活性。已經(jīng)證明，酪蛋白水解物耦合Plastein反應(yīng)修飾后，可以有效改善其抗氧化活性和ACE抑制活性[7-8]。

大豆蛋白水解物具有較好的ACE抑制活性[9]。本研究利用堿性蛋白酶Alcalase制備大豆蛋白水解物，并利用Plastein反應(yīng)對水解物進行修飾，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化修飾反應(yīng)條件，評價修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性，并利用排阻色譜分析修飾產(chǎn)物的肽組成變化，從而為高ACE抑制活性大豆蛋白降壓肽的制備提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆蛋白粉 哈爾濱高科技蛋白有限公司；堿性蛋白酶(酶活力11.3×104U/g) 南寧龐博生物工程有限公司；兔肺丙酮粉、FAPGG(FA-Phe-Gly-Gly) Sigma公司；其他試劑均為分析純，所用水為去離子水或蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401PC型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀 瑞士Foss公司；LGJ-1型空冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DELTA 320型精密pH計 梅特勒-托利多中國有限公司；H-1型微型旋渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；AKTA explorer100型蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng) 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白制備

參照文獻[10]并略作修改。取250g脫脂大豆粉，加入2.5L蒸餾水，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.5，攪拌浸提2h。4000r/min離心20min后，棄去殘渣。2mol/L HCl溶液調(diào)上清液pH值至4.5，靜置1～2h，棄去上清液，下層蛋白質(zhì)凝乳4000r/min離心20min，棄去上清液。蛋白質(zhì)沉淀加500mL蒸餾水，攪拌、離心，棄去上清液；重復(fù)2次。蛋白質(zhì)中加入200mL蒸餾水，1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥即得大豆分離蛋白，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)約為96%(干質(zhì)量)。

1.3.2 大豆蛋白水解物制備

配制質(zhì)量濃度為10g/100mL的大豆分離蛋白溶液，2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，加入堿性蛋白酶(550U/g蛋白質(zhì))，55℃恒溫水浴中進行酶解。不同解時間(0.5～7h)取出樣品20mL，迅速在100℃沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫后6000r/min離心30min，分離出上清液。測定各個上清液的蛋白質(zhì)含量和游離氨基含量，計算其水解度。再將各個上清液稀釋至同一濃度，測定其ACE抑制活性。根據(jù)ACE抑制活性測定結(jié)果，確定適宜的水解時間，放大實驗制備ACE抑制活性最高的大豆蛋白水解物，冷凍干燥后保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 大豆蛋白水解物的Plastein反應(yīng)條件優(yōu)化

采用中心組合試驗，固定反應(yīng)溫度為30℃，以反應(yīng)體系的游離氨基減少量為響應(yīng)值，分別研究酶添加量、底物質(zhì)量分數(shù)、反應(yīng)時間的影響，采用三因素五水平響應(yīng)面方法分析，其因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in central composite design

1.3.4 相關(guān)分析

1.3.4.1 酶活力、蛋白質(zhì)含量、游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度的測定

堿性蛋白酶活力測定參照福林酚法[11].；蛋白質(zhì)含量測定參照凱氏定氮法[12]；游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度(DH)測定參照OPA法[13-14]。

水解度計算公式[15]見式(1)。

式中：5.71為大豆蛋白質(zhì)的換算系數(shù)；0.35為大豆分離蛋白的游離氨基含量/(mmol/g)；7.8為大豆蛋白的肽鍵含量/(mmol/g)；N1為大豆蛋白水解物的氮含量/(mg/mL)。

1.3.4.2 ACE抑制活性分析

參照文獻[16]并略作修改。

ACE酶液提?。喝?0mg兔肺丙酮粉，浸泡于4℃、5mL的100mmol/L硼酸緩沖液(pH8.3)中，4℃恒溫搖床中振搖12h，過濾、清液4℃保存。使用前用緩沖液稀釋至一定倍數(shù)。

FAPGG底物溶液配制：稱取一定量FAPGG溶于100mmol/L pH8.3的硼酸緩沖液(含300mmol/L的NaCl)，配制成1.6mmol/L溶液。

ACE抑制活性測定和計算：將500μL FAPGG底物溶液與100μL超純水或抑制劑(大豆蛋白水解物、修飾反應(yīng)產(chǎn)物或卡托普利)混勻，37℃恒溫水浴中預(yù)熱2min，加入300μL ACE酶液，37℃水浴中反應(yīng)30min，立即加入100μL 100mmol/L的EDTA終止反應(yīng)，再加入3mL超純水稀釋，340nm波長處測定吸光度，平行3次。各個樣品均作0min的對照樣。對照樣先加入EDTA，再加入ACE酶液，其他操作步驟相同。ACE抑制活性計算公式[17]見式(2)。

式中：ΔAc為加入超純水時吸光度在30min內(nèi)的變化；ΔAi為加入抑制劑時吸光度在30min內(nèi)的變化。

IC50值測定和計算：配制不同濃度的ACE抑制劑(抑制肽為mg/mL，卡托普利為nmol/L)，同上步驟測定各濃度ACE抑制劑的ACE抑制活性。以抑制劑濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)、ACE抑制活性為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用回歸方程計算出抑制劑的半抑制濃度(IC50)。IC50定義為抑制ACE酶活力50%時抑制劑的濃度，卡托普利的IC50值經(jīng)過測定為5.2nmol/L。

1.3.4.3 分子排阻色譜分析

參照文獻[18]并略作修改，使用AKTA explorer蛋白質(zhì)快速層析系統(tǒng)、Superdex-7510/300GL(10mm×300mm)色譜柱分析，最大壓力設(shè)定為1.80MPa，流速為0.5mL/min，檢測波長為280nm。開機后，分別用2個柱體積的超純水和洗脫液清洗色譜柱至電導(dǎo)率穩(wěn)定。樣品溶于0.1mol/L Na2HPO4-0.1mol/L NaOH緩沖液(pH12)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.25mg/mL；樣品過0.22μm水膜后進樣量為0.5mL，并用該緩沖液進行洗脫。

1.3.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件和Design Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白水解物的制備

堿性蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，水解產(chǎn)物因水解時間不同其肽分子組成不同，導(dǎo)致其ACE抑制活性不同。不同水解時間的大豆蛋白水解物的水解度與相應(yīng)的ACE抑制活性見圖1。

圖1 水解時間對大豆分離蛋白水解物水解度和ACE抑制活性的影響Fig.1 Effects of hydrolysis time on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of soybean protein hydrolysates

水解反應(yīng)中大豆蛋白水解物的ACE抑制活性隨水解度的增大而增大，4h之后水解物的水解度增加，但是其ACE抑制活性卻降低。數(shù)據(jù)表明，水解反應(yīng)4h時，大豆蛋白水解物中含有ACE抑制活性較高的肽段，水解物的水解度為16.6%、IC50值為1.45mg/mL；隨著水解反應(yīng)進一步進行，ACE抑制活性較高的肽段被水解，且生成的新肽段ACE抑制活性降低，所以整體上大豆蛋白水解物的ACE抑制活性降低。故此，以制備水解時間為4h的大豆蛋白水解物(SPH)作為Plastein反應(yīng)的底物。

Lee等[19]利用4種蛋白酶在一定條件下制備水解度為6%～15%的大豆蛋白水解物，不論使用何種蛋白酶，水解度為15%的水解物其ACE抑制活性均為最高。Tovar-Pérez等[20]用堿性蛋白酶水解一種谷物球蛋白，發(fā)現(xiàn)水解度為13%的水解物其ACE抑制活性最高，IC50值為0.6mg/mL。本研究結(jié)果與上述結(jié)果相似。

2.2 Plastein反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 回歸方程的建立與分析

按照中心組合試驗設(shè)計要求進行20組試驗。酶添加量、底物質(zhì)量分數(shù)和反應(yīng)時間分別用X1、X2、和X3表示，以修飾產(chǎn)物的游離氨基減少量為響應(yīng)值Y，試驗結(jié)果表2。

表2 中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

利用Design Expert 7.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，剔除不顯著因子(X1)后，得到的回歸方程(模型)見式(3)，方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the established regression equation

方差分析結(jié)果表明所得模型顯著(P＜0.0001)，校正確定系數(shù)R2Adj=0.9048表明模型能很好的反映修飾反應(yīng)過程中游離氨基含量的變化，與實際情況擬合較好。另外，通過軟件分析，表明影響響應(yīng)值的各因素主次順序為底物質(zhì)量分數(shù)、反應(yīng)時間、酶添加量。

2.2.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)反應(yīng)條件確定

應(yīng)用Design Expert 7.0軟件中Model Graphs程序作響應(yīng)面曲面圖見圖2～4所示。

底物質(zhì)量分數(shù)和酶添加量對反應(yīng)體系游離氨基減少量的影響見圖2，二者之間相互作用比較小(P＞0.05)，酶添加量對游離氨基減少量的影響也比較小(P＞0.05)。酶添加量一定時，反應(yīng)體系中游離氨基減少量隨底物質(zhì)量分數(shù)的增加而逐漸增大，底物質(zhì)量分數(shù)約45%時達到最大，然后逐漸減小。

圖2 底物質(zhì)量分數(shù)和酶添加量對反應(yīng)體系中游離氨基減少量的響應(yīng)面(X3=4.00)Fig.2 Response surface plot showing the effects of substrate concentration and enzyme loading on decrease of free amino groups in plastein reaction mixture (X3=4.00)

底物質(zhì)量分數(shù)和反應(yīng)時間對反應(yīng)體系游離氨基減少量的影響見圖3，二者之間的相互作用較小(P＞0.05)。隨著底物質(zhì)量分數(shù)增加、反應(yīng)時間延長，游離氨基減少量先逐漸增加，然后逐漸減少。

圖3 底物質(zhì)量分數(shù)和反應(yīng)時間對反應(yīng)體系中游離氨基減少量的響應(yīng)面(X1=400)Fig.3 Response surface plot showing the effects of substrate concentration and reaction time on decrease of free amino groups in plastein reaction mixture (X1=400)

反應(yīng)時間和酶添加量對反應(yīng)體系游離氨基減少量的影響見圖4，二者之間相互作用比較小(P＞0.05)，酶添加量對游離氨基減少量的影響也比較小(P＞0.05)。隨著酶添加量增加，游離氨基減少量呈現(xiàn)減小趨勢，但變化不是很大；隨著反應(yīng)時間延長，游離氨基減少量先逐漸增加，反應(yīng)時間為3～4h之間達到最大，然后逐漸減小。

圖4 反應(yīng)時間和酶添加量對反應(yīng)體系中游離氨基減少量的響應(yīng)面(X2=40)Fig.4 Response surface plot showing the effects of reaction time and enzyme loading on decrease of free amino groups in plastein reaction mixture (X2=40)

綜合分析得到大豆蛋白水解物Plastein反應(yīng)修飾的適宜條件：底物質(zhì)量分數(shù)45%、反應(yīng)時間3～4h，因酶添加量的影響不顯著，選擇275U/g蛋白質(zhì)。

底物質(zhì)量分數(shù)對大豆蛋白水解物的Plastein反應(yīng)修飾的影響最顯著(P＜0.0001)。水解物質(zhì)量分數(shù)較低，會導(dǎo)致水解反應(yīng)過多；水解物質(zhì)量分數(shù)過高，體系的黏度過大不利于Plastein反應(yīng)進行。Sukan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，底物質(zhì)量分數(shù)在20%～40%之間時，Plastein的產(chǎn)量最大。反應(yīng)時間對大豆蛋白水解物Plastein反應(yīng)修飾也有顯著影響(P＜0.01)，游離氨基減少量隨反應(yīng)時間增加而增大，在3～4h時達到最大，然后開始降低，表明過長反應(yīng)時間導(dǎo)致水解反應(yīng)發(fā)生。Williams等[22]在利用胃蛋白酶催化菌蛋白水解物的Plastein反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，65℃反應(yīng)3h時，Plastein產(chǎn)量最大，本研究結(jié)果與之相似。

2.3 修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性與肽組成分析

在底物質(zhì)量分數(shù)45%、酶添加量275U/g蛋白質(zhì)，采用不同反應(yīng)時間制備出9個反應(yīng)程度不同的修飾產(chǎn)物(MPP)，它們的游離氨基減少量及ACE抑制活性(IC50值)列于表4。

表4 大豆蛋白水解物(SPH)以及9個修飾產(chǎn)物(MPP)的ACE抑制活性Table 4 ACE inhibitory activities of SPHs and nine modified products derived from plastein reaction

數(shù)據(jù)表明，在反應(yīng)初始階段(1～4h)反應(yīng)體系中游離氨基減少量逐漸增加，說明發(fā)生縮合反應(yīng)；隨后(反應(yīng)時間4～10h)，游離氨基減少量開始降低，說明反應(yīng)體系中有水解反應(yīng)發(fā)生；當(dāng)反應(yīng)延長至24h，則發(fā)生顯著的水解反應(yīng)，修飾產(chǎn)物的游離氨基比大豆蛋白水解物還高(增加了73.56μmol/g蛋白質(zhì))。不過，與大豆蛋白水解物的IC50值(1.45mg/mL)相比，所有修飾產(chǎn)物的IC50值(0.64～1.30mg/mL)均更小。結(jié)果表明，在修飾反應(yīng)過程中無論是發(fā)生縮合反應(yīng)還是水解反應(yīng)，修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性均提高，幅度可達到10%～120%。數(shù)據(jù)還顯示，ACE抑制活性最高的修飾產(chǎn)物MPP5，其游離氨基減少量不是最大，所以Plastein反應(yīng)程度與ACE抑制活性之間的關(guān)系還需要進一步的研究。

為了進一步說明Plastein反應(yīng)修飾對修飾產(chǎn)物中肽組成的影響，利用排阻色譜對大豆蛋白水解物及1個修飾產(chǎn)物(MPP5)進行分析，結(jié)果見圖5。對比分析看出，修飾產(chǎn)物的肽組成明顯不同于底物，有更多的大分子質(zhì)量肽段存在(即有Plastein生成)，同時伴隨著小分子質(zhì)量肽段的減少。這意味著Plastein的生成可能是修飾產(chǎn)物ACE抑制活性提高的重要原因。所以，Plastein反應(yīng)修飾提高大豆蛋白水解物ACE抑制活性的一個根本原因可能在于：堿性蛋白酶Alcalase對疏水性氨基酸、芳香族氨基酸所形成的肽鍵具有專一性[23]，因此在大豆蛋白水解物的Plastein反應(yīng)修飾時，肽段之間的縮合反應(yīng)將導(dǎo)致所生成的大分子質(zhì)量肽段富含這些氨基酸；由于富含疏水性氨基酸的蛋白質(zhì)水解物具有較高的ACE抑制活性[24]，因此修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性得到提高。

圖5 大豆蛋白水解物(SPH)及其1個修飾產(chǎn)物(MPP5)的排阻色譜分析結(jié)果Fig.5 Size exclusion chromatographic profile for SPHs and nine modified products derived from plastein reaction

利用木瓜蛋白酶催化酪蛋白水解物發(fā)生Plastein反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)修飾產(chǎn)物的DPPH清除活性提高約6～8倍，ABTS+自由基清除活性提高約1倍[7]。Zhao等[8]利用堿性蛋白酶催化酪蛋白水解物發(fā)生Plastein反應(yīng)，酪蛋白水解物的IC50值為47μg/mL，而修飾產(chǎn)物的IC50值則降低至0.5～0.6μg/mL。這些結(jié)果和本研究結(jié)果均顯示，Plastein反應(yīng)修飾可以有效地提高蛋白質(zhì)水解物的生物活性。所以，酶水解大豆分離蛋白以后再耦合Plastein反應(yīng)修飾，是一種制備高ACE抑制活性大豆蛋白降壓肽的新技術(shù)。

3 結(jié) 論

3.1 利用堿溶解、酸沉淀的方法從脫脂豆粉制備大豆分離蛋白，并用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白。在55℃、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、pH8.5、酶添加量550U/g蛋白質(zhì)條件下水解4h，大豆蛋白水解物的水解度為16.6%且具有最高ACE抑制活性，IC50值為1.45mg/mL。

3.2 以反應(yīng)體系游離氨基減少量為響應(yīng)值、通過響應(yīng)面分析法，對大豆蛋白水解物的Plastein反應(yīng)修飾條件優(yōu)化。在30℃時，適宜反應(yīng)條件：酶添加量275U/g蛋白質(zhì)、底物質(zhì)量分數(shù)45%、反應(yīng)時間3～4h，它們對修飾反應(yīng)的影響主次順序為底物質(zhì)量分數(shù)＞反應(yīng)時間＞酶添加量。

3.3 對修飾產(chǎn)物ACE抑制活性評價結(jié)果表明，與大豆蛋白水解物相比，所有的修飾產(chǎn)物的IC50值均更小(0.64～1.30mg/mL)，表明Plastein反應(yīng)修飾可提高其ACE抑制活性。而排阻色譜分析表明，修飾產(chǎn)物中有更多的大分子質(zhì)量肽段存在，推斷Plastein的生成是修飾產(chǎn)物ACE抑制活性提高的重要原因。

3.4 大豆蛋白酶解以及耦合Plastein反應(yīng)修飾，是一種制備高ACE抑制活性大豆蛋白降壓肽的新技術(shù)。

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Preparation of ACE Inhibitory Peptides from Soybean Protein Isolate by Enzymatic Hydrolysis Coupled with Optimized Plastein Reaction

GAO Bo，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)22-0025-06

2010-02-07

國家自然科學(xué)基金項目(30972132)

高博(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：anglebbcgb@126.com

*通信作者：趙新淮(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn