劉 佩，周 倩，沈生榮，阮 暉，馬鎏镠，何國慶*

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

產(chǎn)共軛亞油酸植物乳桿菌的篩選、鑒定與誘變

劉 佩，周 倩，沈生榮，阮 暉，馬鎏镠，何國慶*

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

從傳統(tǒng)泡菜中篩選得到1株乳酸菌lp15能夠合成共軛亞油酸(CLA)，經(jīng)16S rRNA全序列分析法和API系統(tǒng)鑒定法鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。利用人工誘變方法，以lp15為出發(fā)菌株，采用紫外線、硫酸二乙酯(DES)依次誘變處理，經(jīng)進一步液體發(fā)酵復篩獲得多株突變菌株，CLA合成能力較出發(fā)菌株提高了29.3%～52.2%。其中l(wèi)p15-2-1突變菌株為CLA生成能力最高菌株，MRS培養(yǎng)液中添加0.2mg/mL LA培養(yǎng)48h，CLA產(chǎn)量達30.13μg/mL。經(jīng)氣相色譜(GC)檢測分析，產(chǎn)物中cis9, trans11-共軛亞油酸(c9, t11-CLA)占76.5%，trans10, cis12-共軛亞油酸(t10,c12-CLA)占23.5%。

共軛亞油酸；植物乳桿菌；鑒定；誘變；氣相色譜

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是亞油酸的一組位置和構象異構體的總稱。其中CLA的兩種異構體cis9, trans11-共軛亞油酸(c9,t11-CLA)和trans10, cis12-共軛亞油酸(t10,c12-CLA)具有重要的生理功能，比如抗癌(結腸癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌)、提高細胞免疫、降低體脂含量、預防糖尿病的發(fā)生以及抑制動脈粥樣硬化等[1-2]。自然界中CLA主要來源于瘤胃動物肉及奶制品，且CLA的含量隨著動物品種、飼養(yǎng)方式及飼養(yǎng)條件的改變而不同[3]；人乳中CLA含量為0.29%～0.71%，馬乳中為0.05%～0.12%，豬乳中為0.19%～0.27%，而海產(chǎn)品和菜籽油中含量較低，分別為0.03%～0.06%和 0.01%～0.07%。奶及肉制品所含的CLA中，c9,t11-CLA異構體約占75%～90%；而菜籽油中約有50%是c9,t11-CLA，40%是t10,c12-CLA[4-6]。

目前化學法合成法仍是商業(yè)CLA的主要來源，此法所得的CLA中含有約40%的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA異構體，但其中仍含有大量的其他異構體及有毒物質(zhì)，活性異構體的分離純化及應用成本較高[7]。1967年首次報道Butyrivibrio fibrisolvens能夠合成CLA[8]，之后不少研究報道多種微生物能夠發(fā)酵合成CLA[9-11]，其中包括Propionibacterium reudenreichii、Streptococcus salivarius、Lactococcus lac tis、L. d elbrueckii、L. casei、L. acidophilus、L. fermentum、L. reuterii、L.

plantarum等，均能將亞油酸(LA)轉化為CLA(產(chǎn)物主要為c9,t11-CLA和t10,c12-CLA)[12-19]。在CLA合成過程中起主要作用的是亞油酸異構酶，這種酶主要作用在C9和C10位上，主要作用產(chǎn)物為c9,t11-CLA和t10,c12-CLA，并且從P. freudenreichii、P. acidipropionici、P. ac nes、L. acido philus、L. reuterii、Clostridium sporogenes、B. fibrisolvens、Eubacterium lentum等多種微生物中都分離得到了這種酶[20]。由于B. fibrisolvens和C. sporogenes屬于嚴格厭氧菌，而P. acnes則是致病菌，它們在工業(yè)生產(chǎn)上的應用價值極低。而大量乳酸菌能夠轉化合成CLA，這為CLA的微生物合成在工業(yè)生產(chǎn)上的應用開辟了廣闊的前景[21-23]。

本實驗從傳統(tǒng)泡菜中篩選有較高合成CLA能力的乳酸菌株，對菌株進行誘變和菌種鑒定，并對產(chǎn)物進行氣相色譜分析以確定CLA組成，以期為共軛亞油酸微生物轉化合成提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜 市售；硫酸二乙酯(DES) 廈門宏達國際貿(mào)易有限公司；硫代硫酸鈉(SDS) 天津昊路成化工有限公司；亞油酸、共軛亞油酸、亞油酸甲酯、共軛亞油酸甲酯混合標樣(c9,t11-CLAMe和t10,c12-CLAMe) Sigma公司；API 50 CHL液體培養(yǎng)基和API 50 CH菌種鑒定試劑條 上海祥和科學技術有限公司；Ex Taq酶、dNTPs Takara寶生物工程(大連)有限公司；PCR(聚合酶鏈式反應)引物：在以大腸桿菌(E. coli)16S rRNA通用引物27F"和1492R"的基礎上，進行個別調(diào)整，得到引物16S rRNA 5＇：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S rRNA 3＇：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 儀器與設備

TU-1801雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；安捷倫7890氣相色譜儀(配有FID檢測器) 美國安捷倫科技有限公司； PTC0220 PCR儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；JS-380A自動凝膠圖像分析儀 杭州諾丁科學器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

將泡菜汁接種于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后，傾注法倒MRS瓊脂平板，30℃培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于MRS瓊脂斜面上保存。

1.3.2 產(chǎn)共軛亞油酸菌種的篩選

標準曲線制作：將CLA標樣溶于正己烷，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，以正己烷為空白對照，測定233nm波長處的紫外吸光度(A)，以共軛亞油酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[24]。

發(fā)酵培養(yǎng)：菌株在MRS液體培養(yǎng)基中30℃條件下活化兩次。厭氧試管(15mm×160mm)中裝入10mL MRS培養(yǎng)基，LA添加量為0.2mg/mL，菌種接種量為1%(體積分數(shù))，接種后30℃條件下150r/min分別振蕩培養(yǎng)24h。

脂肪酸的提?。赫和檩腿“l(fā)酵液，萃取液水洗兩次，加入無水硫酸鈉吸水干燥，氮氣吹干。

紫外分光光度計檢測：將脂肪酸提取物用3mL正己烷溶解，于233nm波長處測定吸光度，空白對照為與發(fā)酵培養(yǎng)條件相同的MRS(LA添加量為0.2mg/mL)培養(yǎng)液的正己烷提取液[24]。

氣相色譜檢測：在上述脂肪酸提取物中加入5mL 體積分數(shù)5%的鹽酸-甲醇溶液，100℃反應1h，再用5mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，正己烷層用無菌水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，氮氣吹干，用100μL正己烷重新溶解后，氣相色譜檢測[25]；色譜條件如下：色譜柱：安捷倫HP-88毛細管柱(60m×0.25mm，0.20μm)；升溫程序：90℃保持5min，以10℃/min升至180℃，保持10min；再以5℃/min升至220℃，保持15min；再以5℃/min升至250℃，保持5min；載氣(H2)；進樣量1μL；分流比5∶1。

1.3.3 菌種的鑒定

1.3.3.116 S rRNA全長序列分析鑒定

乳酸菌菌株基因組DNA提?。喝?mL過夜培養(yǎng)菌液，8000r/min離心2min獲得菌體，將其懸浮于700μL緩沖液(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L pH8.0的Tris-HCl、10mmol/L EDTA)中。加入質(zhì)量濃度為40mg/mL的溶菌酶25μL，37℃溫浴30min。再加入100μL 0.1g/mLSDS，60℃保溫1h，使細菌細胞完全裂解。12000r/min離心10min，取上清液加入等體積的苯酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1，V/V)混合物，抽提至界面沒有白色沉淀為止。取上清液加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和兩倍體積的無水乙醇，混勻后，－20℃放置30min。之后12000r/min離心10min，棄上清液，沉淀用體積分數(shù)70%乙醇溶液清洗，在空氣中干燥后，用100μL TE緩沖液溶解。

菌株16S rRNA全長序列PCR擴增：PCR反應體系(50μL)：取菌株基因組DNA 1μL作為PCR反應模板，dNTPs(25mmol/L)4μL，10×PCR buffer(含Mg2+)5μL，引物16S rRNA5＇(10μmol/L)1μL，16S rRNA3＇(10 μmol/L) 1μL，Takara Ex Taq酶(5U/μL)0.25μL。

PCR反應程序為94℃預變性5min，然后是30個循環(huán)：94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s；最后是72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物技術有限公司測序，所得序列應用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(http∶// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的已有細菌16S rRNA序

列進行相似性比較分析。

1.3.3.2 API試劑盒測定

將培養(yǎng)后的菌株lp15接入API 50CHL液體培養(yǎng)基中，制成菌懸液，然后接入API 5 0CHL菌種鑒定試劑條，無菌液體石蠟封口，30℃培養(yǎng)24、48h，觀察并記錄菌種對49種碳水化合物的利用情況。之后采用API公司細菌鑒定系統(tǒng)以及IBIS(intelligent bacteria identification system)軟件系統(tǒng)對菌種進行鑒定[26]。

1.3.4 高產(chǎn)菌種的誘變選育

誘變方法參考文獻[27]，紫外誘變時間為5、10、15、20、25、30、35s；DES誘變體積分數(shù)為1%和2%；時間分別為10、20、30、40、50min；反應結束后分別加入2g/100mL的Na2S2O5溶液于37℃反應5min終止反應。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)CLA菌株的分離、篩選

CLA紫外吸收標準曲線：CLA紫外吸收標準曲線的線性回歸方程為A=0.1058C+0.1452，式中：A為共軛亞油酸標樣在233nm波長處的吸光度，C為CLA標樣的質(zhì)量濃度(μg/mL)，線性范圍為0～18μg/mL。

菌種篩選：從3種泡菜樣品中分離出53株乳酸菌。利用紫外分光光度計檢測發(fā)酵液中CLA含量，實驗表明菌液培養(yǎng)24h時，43株菌中能夠檢測到CLA生成，含量在5～11.85μg/mL；而其中15號菌株的CLA產(chǎn)量最高，命名為lp15(圖1)。

圖 1 不同菌株轉化合成CLA的能力Fig.1 CLA biosynthesis capabilities of various strains

2.2 菌種鑒定

16S rRNA分子鑒定：利用16S rRNA 5＇和3＇引物對菌株lp15以及實驗室保存植物乳桿菌ACCC10171的16S rRNA序列進行擴增，PCR擴增產(chǎn)物大小約為1500bp(圖2)，測序結果表明，菌株lp15的16S rR NA全長為1471bp，Genbank登錄號為：FJ763580；植物乳桿菌ACCC10171的16S rRNA全長為1468bp。經(jīng)比對，菌株lp15與植物乳桿菌ACCC10171 16S rRNA序列同源性達99.2%，而Blast后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)結果表明，菌株lp15屬于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

圖 2 菌株lp15及植物乳桿菌ACCC10171的16SrRNA全長序列PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16SrRNA of strain lp15 and ACCC10171

圖 3 菌株lp15的16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain lp15 according to 16SrRNA

表 1 菌株lp15 API試劑盒反應結果Table 1 API reaction results of strain lp15

用API試劑盒進行菌種lp15利用49種碳水化合物的發(fā)酵實驗，結果見表1。

將實驗結果輸入梅里埃(BioMe rieux)的API細菌鑒定系統(tǒng)，查詢數(shù)據(jù)庫，鑒定結果表明lp15為乳酸菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，與16S rRNA序列鑒定結果一致。

2.3 菌種誘變選育

不同劑量紫外線、DES處理與菌體致死率的關系見圖4，有資料表明，用小劑量進行誘變處理時，致死率在50%～80%之間，單位存活細胞中正突變菌株數(shù)量較多[23]。

圖4 紫外線照射時間(A)、DES體積分數(shù)和處理時間(B)與細胞致死率關系Fig.4 Effect of UV and DES on cell death rate of strain lp15

由圖4可見，lp15最適合紫外誘變時間為20s(致死率約70%)；1% DES誘變30min或者2% DES誘變20min (致死率約70%)。以lp15為出發(fā)菌株進行紫外線、DES誘變，提高了菌株生成CLA的能力，誘變得到多株突變菌株，CLA的生成能力較出發(fā)菌株提高幅度在29.3%～52.2%。其中突變菌株lp15-2-1CLA生成能力提高幅度最大，達到52.2%。

2.4 菌株lP15-2-1發(fā)酵液中CLA異構體的氣相色譜分析

圖 5 共軛亞油酸氣相色譜圖Fig.5 GC chromatogram of MRS broth before and after 48 h incubation with LA and CLA standard mixture

利用氣相色譜分析法對lp15-2-1發(fā)酵液中的脂肪酸進行分析，結果見圖5。

圖5A是亞油酸甲酯和共軛亞油酸甲酯標準樣品的氣相色譜圖，其中LA的保留時間是31.263min，而CLA兩種異構體c9,t11-CLA和t10,c12-CLA得到了較好的分離，其保留時間分別為33.384min和33.617min。圖5B、5C分別是lp15-2-1菌株在MRS培養(yǎng)基中添加0.2mg/mL LA，30℃，150r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)0h和48h的氣相色譜圖。發(fā)酵培養(yǎng)48h時，CLA總含量達30.13μg/mL；從圖5C中可以看出lp15-2-1菌株主要將LA轉化為兩種CLA異構體，其中c9,t11-CLA是主要異構體，占76.5%，t10,c12-CLA異構體含量較少，占23.5%。

3 討論與結論

泡菜是一種獨特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，制作容易，營養(yǎng)衛(wèi)生、風味可口、貯存便利；在我國四川、東北、湖南、湖北、河南、廣東、廣西等地民間均有自制泡菜的習慣；而泡菜汁中含有豐富的活性乳酸菌，尤其是植物乳桿菌，因此它不僅是傳統(tǒng)的佐食，還能夠成為具有我國傳統(tǒng)特色的、廉價的、高效的天然微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。

而近年來關于乳酸菌能夠發(fā)酵合成CLA的研究大量增加，本實驗從傳統(tǒng)泡菜中篩選得到一株乳酸菌lp15，能夠轉化LA為CLA；通過16S rRNA全長序列分析和API試劑盒鑒定均證明該菌株為植物乳桿菌；之后，采

用紫外線、硫酸二乙酯(DES)依次誘變處理，篩選得到突變株lp15-2-1，共軛亞油酸合成能力較出發(fā)菌株提高了52.2%。在MRS培養(yǎng)液中添加0.2mg/mL LA培養(yǎng)48h，共軛亞油酸產(chǎn)量達30.13μg/mL；經(jīng)氣相色譜檢測得知，產(chǎn)物為有生物活性的異構體c9, t11-CLA(76.5%)和t10, c12-CLA(23.5%)。研究表明：泡菜中含有大量能夠合成CLA的乳酸，并且植物乳桿菌較為豐富；菌株的食品級來源大大保證了其安全性且菌株轉化合成CLA異構體較為專一，因而有效的擴大了CLA的膳食來源范圍并為提高食品中CLA含量開辟了新的途徑。

[1]PARIZA M W, PARK Y, COOK M. The biologically active isomers of conjugated linoleic acid[J]. Prog Lipid Res, 2001, 40(4)∶ 283-298.

[2]劉佩, 沈生榮, 阮輝, 等. 共軛亞油酸的生理學功能及健康意義[J].中國糧油學報, 2009(6)∶ 161-164.

[3]PETERSON D G, KEISEY J A. Analysis in variation in cis-9, trans-11-conjugated linoleic acid (CLA) inmilk fat of dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2002, 85(9)∶ 2164-2172.

[4]JAHREIS G, FRITSCHE J, MOCKEL P, et al. The potential anticarcinogenic conjugated linoleic acid, cis-9, trans-11-C18∶2, in milk of different species∶ Cow, goat, ewe, sow, mare, woman[J]. Nutr Res, 1999, 19(10)∶ 1541-1549.

[5]LOCK A L，BAUMAN D E，GARNSWORTHY P C. Effect of production variables on the cis-9,trans-11 conjugated linoleic acid cotent of cows’milk[J]. J Dairy Sci, 2005, 88(8)∶ 2714-2717.

[6]ZENG Z, LIN J, GONG D. Identification of lactic acid bacterial strains with high conjugated linoleic acid-producing ability from natural sauerkraut fermentations[J]. J Food Sci, 2009, 74(4)∶ 154-158.

[7]郭諍, 張根旺, 孫彥. 共軛亞油酸制備方法的研究進展[J]. 化學通報, 2003, 66(9)∶ 592-597.

[8]KEPLER C R, TOVE S B. Biohydrogenation of unsaturated fatty acid [J]. J Biol Chem, 1967, 242(24)∶ 5686-5692.

[9]熊向峰, 陳朝銀, 趙聲蘭. 亞油酸異構酶及性質(zhì)[J]. 工業(yè)微生物, 2002, 32(4)∶ 51-54.

[10]章亭洲. 共軛亞油酸的營養(yǎng)分配作用及生物合成研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(10)∶ 92-96.

[11]吳祖芳, 石清花, 翁佩芳. 生物轉化法生產(chǎn)共軛亞油酸及其研究進展[J]. 中國糧油學報, 2005, 20(6)∶ 84-87.

[12]JIANG J, BJORCK L, FONDEN R. Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures[J]. J Appl Microbiol, 1998, 85(1)∶ 95-102.

[13]LIN T Y, LIN C W, LEE C H. Conjugated linoleic acid concentrauion as affected by lactic cultures and added linoleic acid[J]. Food Chem, 1999, 67∶ 1-5.

[14]LIN T Y, H UNG T H, CHENG T S J. Conjugated linoleic acid production by immobilized cells of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Lactobacillus acidophilus[J]. Food Chem, 2005, 92(1)∶1-6.

[15]OGAWA J, MATSUMURA K, KISHINO S, et al. Conjugated linoleic acid accumulation via 10-hydroxy-12-octadecannioc during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus[J]. Appl Environ Micobiol, 2001, 67∶ 1246-1252.

[16]邵群, 張慧, 邊際, 等. 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生共軛亞油酸條件的研究[J].山東師范大學學報∶ 自然科學版, 2001, 16(4)∶ 443-446.

[17]KIM Y J, LIU R H. Increase of conjugated linoleic acid content in milk by fermentation with lactic acid bacteria[J]. J Food Sci, 2002, 67(5)∶1731-1737.

[18]LEE S O, KIM C S, CHO S K, et al. Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and by washed cells of Lactobacillus reuteri[J]. Biotechnol Lett, 2003, 25(12)∶ 935-938.

[19]張忠義, 胡錦蓉, 劉萍, 等. 產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的篩選及產(chǎn)物分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2004, 9(3)∶ 5-8.

[20]LIN T Y, LIN C W, WANG Y J. Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts from Lactobacillus acidophilus and Propionibacterium freudenreichii[J]. J Food Sci, 2002, 67(4)∶ 1502-1505.

[21]CHUNG S H, KIM I H, PARK H G, et al. Synthesis of conjugated linoleic acid by human-derived Bifidobacterium breve LMC 017∶ utilization as a functional starter culture for milk fermentation[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(9)∶ 3311-3316.

[22]KIM Y J, LIU R H. Increase of conjugated linoleic acid content in milk by fermentation with lactic acid bacteria[J]. J Food Sci, 2002, 67(5)∶1731-1737.

[23]ALONSO L, CUESTA E P, GILLILAND S E. Production of free conjugated linoleic acid by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei of human intestinal origin[J]. J Dairy Sci, 2003, 86(6)∶ 1941-1946.

[24]PARIZA M W, YANG X Y. Method of producing conjugated fatty acids∶USA, 6060304[P]. 2000-05-09.

[25]XU H, LEE H Y, WHANG B. Kinetics of microbial hydrogenation of free linoleic acid to conjugated linoleic acids[J]. Journal of Applied Microbiology, 2008, 105(6)∶ 2239-2247.

[26]WIJTZES T, BRUGGEMAN M R, NOUT M J, et a1. A cornputerised system for the identification of lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 38(1)∶ 65-70.

[27]張中義. 植物乳桿菌轉化亞油酸生成共軛亞油酸的研究[D]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)大學, 2004.

Screening, Identification and Breeding of Conjugated Linoleic Acid-producing Lactobacillus plantarum by Mutation

LIU Pei，ZHOU Qian，SHEN Sheng-rong，RUAN Hui，MA Liu-liu，HE Guo-qing*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

A lactic acid bacterial strain, lp15, having the ability to synthesize conjugated linoleic acid (CLA) was isolated from pickle juice samples. The strain lp15 was identified as Lactobacillus plantarum based on full-length 16S rRNA sequence analysis and API system. This strain was treated by ultraviolet and DES to obtain several mutant strains, which exhibited 29.3%－52.2% enhancement for CLA production. The strain lp15-2-1 exhibited the highest CLA productivity, which was up to 30.13 μg/mL after 48 h culture in the MRS medium added with LA at 0.2 mg/mL level. According to gas chromatographic analysis, cis9, trans11-CLA was the predominant compound in the fermentation product, with a relative content of up to 76.5%. trans10, cis12-CLA approximately accounted for 23.5% of the fermentation product.

conjugated linoleic acid (CLA)；Lactobacillus plantarum；identification；mutation；gas chromatography (GC)

TS218

A

1002-6630(2010)09-0135-05

2009-08-20

國家“863”計劃重點項目(2007AA100402)

劉佩(1983—)，女，博士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：liupei83224@163.com

*通信作者：何國慶(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與發(fā)酵工程。E-mail：gqhe@zju.edu.cn