劉小娟，龐廣昌*，李 楊

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

ω-6亞油酸對小鼠免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用

劉小娟，龐廣昌*，李 楊

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134)

目的：探索ω-6亞油酸對小鼠免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。方法：將市購的ω-6亞油酸以口服、腹腔注射、耳靜脈注射3種方式作用于小鼠，分別在3、2、2h后取血分離血清，用液體芯片檢測技術(shù)測定小鼠血清中的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12(p40)、IFN-γ、G-CSF、MCP-1、VEGF等24種細胞因子含量的變化。結(jié)果：灌胃組中顯著升高的細胞因子有IL-1α、Eotaxin和VEGF，顯著降低的有IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC；腹腔注射組中炎癥細胞因子IL-1和IL-17顯著升高的同時也伴隨著IL-4、IL-10抗炎細胞因子的顯著升高以及趨化因子G-CSF的顯著降低；靜脈注射組總體表現(xiàn)為促炎作用，IL-2、IL-5、IL-6濃度顯著升高，抗炎細胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17濃度顯著降低。結(jié)論：ω-6亞油酸能通過小鼠胃腸黏膜系統(tǒng)和血液系統(tǒng)傳遞信號，調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)。灌胃組主要激活了PKC/NF-κB途徑以及STAT的部分途徑，抑制NF-κB、JAK-STAT3、PI3K途徑；腹腔注射組激活的信號途徑有NF-κB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途徑，抑制STAT3途徑；靜脈注射組激活的信號途徑有NF-κB、MAPK和JAKSTAT3。抑制的信號途徑有PI3K/ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5。

ω-6亞油酸；細胞因子；信號途徑；植物非營養(yǎng)成分

膳食纖維中的植物非營養(yǎng)成分(phytochemicals)也叫植物營養(yǎng)素，已經(jīng)成為一個熱門議題，有數(shù)十類不同化學結(jié)構(gòu)的植物非營養(yǎng)成分已經(jīng)被鑒定出來，包括類胡蘿卜素、植物固醇、皂苷、植酸、多酚、植物雌激素類等。許多體外實驗表明植物營養(yǎng)素都有抗癌(作用機制主要是抑制NF-κB和MAPK信號途徑)、抗氧化、降低膽固醇、抑制腸道病原菌[1]、調(diào)節(jié)免疫的作用。其中亞油酸不僅是人體不可缺少的必需脂肪酸，更重要的是它們在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為多種在人體生理活動中起著重要作用的多不飽和脂肪酸，與人體心血管疾病的控制(如能夠顯著影響脂蛋白代謝，從而改變心血管疾病的危險性，影響動脈血栓形成和血小板功能，影響動脈粥樣硬化細胞免疫應答及炎性反應)[2]、免疫調(diào)節(jié)、細胞生長以及抗癌作用等息息相關(guān)。亞油酸衍生為花生四烯酸(AA)后，在環(huán)氧化酶和脂氧化酶的作用下，分別合成PGs2系列(前列腺素、前列腺環(huán)素和TX2)和LTs4系列(4系白三烯)。已知這些介質(zhì)可以介導炎癥反應[3]?；ㄉ南┧?AA)和前列腺素(PG)主要是與急性炎癥有關(guān)。AA、PGE1(前列腺素E1)或PGE2(前列腺素E2)兔眼結(jié)膜下注射，可使眼結(jié)膜血管擴張、微血管通透性增加而致紅腫，家兔或大鼠靜脈或腦室內(nèi)注射AA可引起體溫升高[4]。

本研究使用ω-6亞油酸對小鼠通過灌胃、腹腔注射、耳靜脈注射3種方式，檢測其血清中24種細胞因子的濃度變化情況，探索ω-6亞油酸對細胞因子可能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用和作用途徑，從而推測ω-6亞油酸對機體產(chǎn)生的免疫功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Bal b/c小鼠，雄性，清潔級，8～9周齡，20～25g/只，購自天津市利居生物用品供應中心。

ω-6亞油酸 天津科瑞杰生物技術(shù)開發(fā)有限公司；20～200μL，100～1000μL可調(diào)式移液器，Thermo熱電(上海)儀器有限公司；DDH2O、Millipore mouse 試劑盒96孔酶標板 Millipore公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 德國西格馬實驗離心機有限公司；光照生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；Millipore液體芯片掃描儀 Millipore公司；-70℃冷凍冰箱 Sanyo公司；水平振蕩器(能調(diào)溫)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

Bal b/c小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成3組：口服灌胃組、腹腔注射組、靜脈注射組，每組6只小鼠，包括3只實驗鼠和3只空白對照小鼠?？诜辔附M亞油酸的劑量為2000μL/kg bw，腹腔注射組的劑量為800μL/kg bw，靜脈注射組的劑量為400μL/kg bw，空白對照鼠給與實驗鼠同等劑量同等方式的0.9%生理鹽水。在實驗前一天晚上禁食，口服灌胃組在服用亞油酸后3h摘除眼球取血，注射組在注射亞油酸后2h摘除眼球取血(本實驗室通過給小鼠注射或者口服脂多糖LPS，系統(tǒng)研究了細胞因子的漲落規(guī)律，發(fā)現(xiàn)口服需要3～4h，注射則只有2～3h[5])，4℃、3500r/min離心15min，分離血清離心15min，分裝，-20℃保存待測。

1.3.2 小鼠血清中細胞因子濃度的測定

用Millipore mouse 試劑盒檢測小鼠24種細胞因子的水平。本實驗檢測的24種細胞因子中包括：白細胞介素類：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17；干擾素類：IFN-γ；腫瘤壞死因子類：TNF-α；集落刺激因子：G-CSF、GM-CSF；趨化因子類：Eotaxin、KC、MCP-1、IP-10、MIP-1 α、RANTES、VEGF。

式中：MFI值即熒光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組均數(shù)的比較采用方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。所有柱形圖、曲線圖應用Excel繪制。

2 結(jié)果與分析

2.13 種方式下ω-6中的亞油酸對小鼠24種細胞因子的作用

灌胃、腹腔注射和靜脈注射3種作用方式下ω-6亞油酸對小鼠24種細胞因子的作用如圖1所示。

如果老年人出現(xiàn)突發(fā)性耳聾，可使用抗病毒和擴血管、溶栓的藥物營養(yǎng)神經(jīng)，通過吃藥和輸液都可以，也可以使用激素類藥物減輕內(nèi)耳水腫，緩解突發(fā)性耳聾。如果是由糖尿病、血管疾病等引起，就針對病因控制血糖或改善血液循環(huán)。有時游泳、沐浴時耳道進水，耳垢體積膨脹，突然感覺耳聾，只需取出栓塞即可。慢性中耳炎可導致鼓膜穿孔、炎癥性肉芽腫、鈣化灶等病變，須及時進行治療。要特別提醒的是，老人出現(xiàn)突發(fā)性耳聾，應及時帶老人到醫(yī)院檢查治療，一直拖著不治療，發(fā)展下去就會全聾，即使使用助聽器也無效。

圖1 3種方式下ω-6亞油酸對小鼠24種細胞因子的作用Fig. 1 Effects ofω-6 linoleic acid using three different delivery methods on 24 cytokines in mice

表1 各類細胞因子的變化(亞油酸)Table 1 Changes of cytokines in mice administered with linoleic acid

表2 統(tǒng)計學t檢驗變化顯著的細胞因子(亞油酸)Table 2 Significant change of cytokines in mice administered with linoleic acid

與對照組相比各種細胞因子的變化情況見表1。在灌胃組中，IL-3、IL-4、TNF-α、IP-10在口服前后濃度沒有明顯變化，給小鼠口服灌胃亞油酸后，上調(diào)了IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-17、IFN-γ、Eotaxin、MCP-1、MIP-1α、RANTES、VEGF的表達量，即實驗組在被檢血清中的濃度高于對照組中的濃度。IL-2、IL-6、IL-12(p40)、IL-13、G-CSF、GM-CSF、KC 七種細胞因子在灌胃后，血清中的濃度低于對照組的濃度。

在腹腔注射組中，IP-10、MCP-1在注射前后濃度沒有明顯變化，在檢測結(jié)果中，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、MIP-1α、RANTES、VEGF的濃度高于對照組中細胞因子的濃度。IL-6、Eotaxin、G-CSF、KC的濃度低于對照組。

在靜脈注射組中， Eotaxin、RANTES在注射前后濃度沒有明顯變化，在給小鼠靜脈注射亞油酸后，上調(diào)了IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、TNF-α、G-CSF、KC、IP-10、MCP-1、MIP-1α、VEGF的表達量，即實驗組的濃度高于對照組中細胞因子的濃度。IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、IFN-γ、GM-CSF的濃度低于對照組。

2.2 顯著性分析

應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗結(jié)果進行方差t檢驗，根據(jù)P值進行顯著分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，在灌胃組中，VEGF與對照組相比具有極顯著性差異，IL-1α、Eotaxin、VEGF的濃度顯著升高，IL-6、IL-12(p40)、G-CSF、KC與對照組相比顯著降低；在腹腔注射組中，IL-1α、IL-10與對照組相比具有極顯著性差異，IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17的濃度顯著升高，G-CSF與對照組相比顯著降低；在靜脈注射組中，IL-4 、IL-9、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-17與對照組相比具有極顯著性差異，IL-2、IL-5、IL-6的濃度顯著升高，IL-3、IL-4 、IL-9、IL-10、IL-12 (p40)、IL-12(p70)、IL-17與對照組相比顯著降低。

3 討 論

細胞因子是由機體免疫細胞和非免疫細胞合成和分泌的具有高效性、多功能的多肽類因子，可以作用于其他細胞受體，在分子水平上調(diào)節(jié)多種細胞的功能[6]。免疫細胞和非免疫細胞分泌的細胞因子可以作用于其他細胞的受體，在分子水平上調(diào)節(jié)多種細胞生理功能[7](表3)。它們和相應的靶細胞外膜上的受體結(jié)合，依賴于細胞和所作用的細胞因子產(chǎn)生某種應答。而且經(jīng)常是靶細胞在細胞因子的刺激下產(chǎn)生另外的細胞因子。它們主要作為細胞間的信號傳遞分子，介導和調(diào)節(jié)機體免疫應答、細胞分化、造血、腫瘤免疫等多種生理及病理過程。總之，機體免疫應答的發(fā)生發(fā)展，以及發(fā)炎細胞因子和抗炎細胞因子之間相互作用和相互平衡構(gòu)成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)[8-11]。

表3 幾種顯著變化的細胞因子的生物功能及其介導的信號途徑Table 3 Functions and signal pathways of cytokines with significant change

腹腔注射組沒有經(jīng)過胃腸道，是直接對腸黏膜系統(tǒng)發(fā)揮作用的。炎癥細胞因子IL-1和IL-17升高的同時也伴隨著IL-4、IL-10抗炎細胞因子的升高以及趨化因子G-CSF的降低，亞油酸作用于腹腔內(nèi)的共同黏膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immunity system，CMIS)時[15]，腸道上皮細胞(M細胞)、淋巴細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞、NK細胞等發(fā)出炎癥信號產(chǎn)生一系列相應的細胞因子，如本研究中的IL-1、INF-γ等，接著，胞內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和去磷酸化(表3)使這些細胞因子的信號被放大，促進Th0向Th2細胞極化，分泌IL-4、IL-10等抗炎細胞因子來中和過高的炎癥反應。說明隨著時間的延長，機體會產(chǎn)生抗炎細胞因子來平衡過高的炎癥，激活的信號途徑有NF-ΚB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途徑，抑制STAT3途徑。

靜脈注射組是避開腸胃道及黏膜系統(tǒng)直接進入血液作用于小鼠的，總體表現(xiàn)為促炎作用。IL-2、IL-5、IL-6濃度顯著升高，抗炎細胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17濃度顯著降低。激活的信號途徑有NF-κB、MAPK、和JAKSTAT3。抑制的信號途徑有PI3K/ ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5，可能是由于亞麻酸除了能通過旁分泌參與免疫反應外還能影響靜脈中的一些蛋白因子，形成更復雜的關(guān)系。有文獻[16-17]表明亞油酸能抑制血小板活化因子(PAF)的產(chǎn)生(PAF由單核細胞產(chǎn)生，活化血小板，促進動脈粥樣硬化形成)；抑制血小板衍生生長因子(PDGF)(PDGF能導致動脈血管壁平滑肌細胞、纖維細胞、巨噬細胞的遷移和增加)；降低極低密度脂蛋白VLDL(VLDL是心血管病的危險因素)；抑制脂蛋白(α)(LP(α))的產(chǎn)生(LP(α)有致動脈粥樣硬化形成和血栓形成作用，它的載脂蛋白分子結(jié)構(gòu)與纖維蛋白溶酶原很相似，是纖維蛋白溶酶原活化劑的抑制劑，使纖維蛋白不易溶解)。

4 結(jié) 論

灌胃組中大部分白介素類細胞因子沒有顯著性變化，趨化因子的變化情況比較顯著。IL-1α、Eotaxin和VEGF的濃度顯著性升高，IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC濃度顯著降低。亞油酸在經(jīng)過胃腸道消化吸收后，與腸黏膜上的上皮細胞受體結(jié)合，激活了PKC/NF-κB途徑以及STAT的部分途徑促進IL-α、Eotaxin和VEGF的表達，對NF-κB、JAK-STAT3、PI3K途徑的抑制可能導致IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC濃度的降低。腹腔注射組中炎癥細胞因子IL-1和IL-17升高的同時也伴隨著IL-4、IL-10抗炎細胞因子的升高以及趨化因子G-CSF的降低，說明隨著時間的延長，機體會產(chǎn)生抗炎細胞因子來平衡過高的炎癥，激活的信號途徑有NF-κB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途徑，抑制STAT3途徑。靜脈注射組總體表現(xiàn)為促炎作用。IL-2、IL-5、IL-6濃度顯著升高，抗炎細胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17濃度顯著降低。激活的信號途徑有NF-κB、MAPK、和JAKSTAT3。抑制的信號途徑有PI3K/ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5。

有研究表明不飽和脂肪酸(PUFA)在組織培養(yǎng)中能抑制3種腹水癌的生長，對淋巴肉瘤也有很好的抑制作用，其中以亞油酸與亞麻酸的作用最強，大劑量(100～200mg/kg)的亞油酸腹腔注射，可以完全抑制肉瘤S37的生長，并使小鼠淋巴細胞性白血病(腹水型)小鼠的存活時間延長[18]。本實驗主要研究口服ω-6亞油酸后對機體免疫系統(tǒng)的作用，輔以小劑量的腹腔注射和靜脈注射方式作為對照(亞油酸是一種脂溶性物質(zhì)，注射劑量要在風險范圍之內(nèi))，相對于靜脈注射組表現(xiàn)出的顯著促炎作用，口服途徑對機體的作用就表現(xiàn)得相對均衡，可見口服ω-6亞油酸是一種安全科學的方式，它不僅作為食物給機體提供了必需的營養(yǎng)，最重要的是它能通過腸黏膜系統(tǒng)傳遞信息從而調(diào)節(jié)機體的免疫活動。在營養(yǎng)相對過剩的今天我們還是希望合理飲食，不要過分追求食用所謂增強免疫的食品。最好不要通過注射的形勢給機體所謂“免疫增強”食品，本研究的結(jié)果表明服用過多的ω-6亞油酸反而可能會降低食欲，增加機體過頭的炎癥應答。

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Regulatory Function of ω-6 Linoleic Acid on Mouse Immune System

LIU Xiao-juan，PANG Guang-chang*，LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: To explore the effect of ω-6 linoleic acid on cytokines of mice. Methods: The mice were administered with linoleic acid by intragastric administration, intraperitoneal injection and vein injection respectively. At 3, 2 h and 2 h after administration, the concentration changes of 24 cytokines including IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 (p40), IFN-γ, G-CSF, MCP-1 and VEGF in mouse serum were determined. Results: An obvious increase in IL-1, Eotaxin and VEGF, and significant decline in IL-6, IL-12 (p40), G-CSF and KC were observed in mice with intragastric administration of ω-6 linoleic acid; In intraperitoneal injection group, the concentration of IL-1, IL-17, IL-4, IL-10 exhibited an obvious increase, whereas GCSF exhibited an obvious decrease; The mice in vein-injection group showed a remarkable change with inflammation, which exhibited a dramatic increase of IL-2, IL-5 and IL-6, and a significant decrease of IL-3, IL-4, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), and IL-17. Conclusion: ω-6 linoleic acid can transfer signal through mucosal immunity of intestine and blood system to regulate immune system. In intragastric administration group, PKC/NF-κB and partial STAT pathways can be activated and JAK-STAT3 and PI3K pathways can be inhabited; in intraperitoneal injection group, NF-κB, JNK/p38/MAPK, PI3K and JAK/STAT6 can be activated and STAT3 can be inhabited; in vein-injection group, NF-κB, MAPK and JAK/STAT3 can be activated, and PI3K/ATK, ERK/MAPK and STAT1, 4, 5 can inhabited. Nowadays, due to excessive nutrition for some people, it is not scientific strategy for these people to pursue immune-enhancing food, which can keep their body in a continuous inflammation status. Therefore, our health should be result from a dietary structure that is benefit for immune balance.

ω-6 protein；cytokine；signal pathway；phytochemicals

Q178.535

A

1002-6630(2010)23-0375-05

2010-09-25

國家自然科學基金項目(30871951)

劉小娟(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)的分離純化。E-mail：llxjj1236@163.com

*通信作者：龐廣昌(1956—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)及食品免疫學。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn