高兆建，侯進(jìn)慧，孫會(huì)剛，刁進(jìn)進(jìn)

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

耐高溫β-半乳糖苷酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析

高兆建，侯進(jìn)慧，孫會(huì)剛，刁進(jìn)進(jìn)

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

為從嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)XG24發(fā)酵液中純化到β-半乳糖苷酶，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，利用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-75分子篩凝膠過(guò)濾層析等方法進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)系列步驟純化后，酶純度提高了54.5倍，回收率20.4%，酶比活力達(dá)32.7U/mg。以鄰-硝基酚-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)為底物，研究β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。最適pH6.5，最適作用溫度65℃。此菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶在70℃以下和pH4.0～8.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+對(duì)此酶有明顯激活作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+幾乎完全抑制酶活性。以O(shè)NPG為底物酶的Km值為4.32mmol/L。SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾層析測(cè)得酶蛋白為單肽鏈蛋白，表觀分子質(zhì)量64kD。因此，嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

嗜熱脂肪芽孢桿菌；β-半乳糖苷酶；分離純化；性質(zhì)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC 3.2.1.23)，又稱(chēng)乳糖酶，能夠催化β-D-半乳吡喃糖苷水解或者轉(zhuǎn)糖基化。該酶廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、細(xì)菌、酵母、真菌或霉菌中[1-3]。β-半乳糖苷酶將牛乳或其他乳制品中的乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，降低乳制品中乳糖含量，提高乳制品的可消化性[4-5]，廣泛用于低乳糖牛奶和非結(jié)晶型濃縮牛奶的生產(chǎn)，解決世界一半以上人口存在的乳糖不耐癥問(wèn)題[6]，β-半乳糖苷酶還具有半乳

糖苷轉(zhuǎn)移作用，用于生產(chǎn)雙歧因子-低聚半乳糖[7-8]，從而在益生菌食品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。β-半乳糖苷酶在食品中的重要應(yīng)用價(jià)值引起人們對(duì)它的廣泛關(guān)注。由于微生物的快速生長(zhǎng)、高效代謝以及分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，使微生物β-半乳糖苷酶成為工業(yè)化酶制劑的主要來(lái)源。目前乳品工業(yè)用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多從經(jīng)誘導(dǎo)的酵母、米曲霉、黑曲霉或乳酸菌產(chǎn)酶后提取獲得，但是均存在熱穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了它在乳制品中的應(yīng)用。采用高溫型β-半乳糖苷酶能夠克服這缺陷。酶在60℃以上溫度水解乳糖，可以有助于抑制雜菌微生物的生長(zhǎng)，而且酶反應(yīng)速度快，酶用量低，反應(yīng)時(shí)間短，生產(chǎn)中可與巴氏殺菌同時(shí)進(jìn)行或冷卻階段保溫水解。因此，乳糖酶的研究日益引起人們的重視[9]。

目前，已經(jīng)篩選分離了多種β-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌[10]、乳酸菌屬[11]、芽孢桿菌屬[12]、曲霉菌屬[13]等系列菌株。但是，大部分β-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定范圍較窄，穩(wěn)定性較差。故研究熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶成為研究的熱點(diǎn)，如海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)[14]，嗜熱古細(xì)菌(Pyrococcus woesei)[15]，嗜熱棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)[16]。但對(duì)于嗜熱脂肪芽孢桿菌β-半乳糖苷酶國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室從溫泉附近土壤中篩選到一株極高耐熱性的嗜熱脂肪芽孢桿菌，初步研究發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶耐熱性強(qiáng)、酶活性高。對(duì)酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究為今后從分子與結(jié)構(gòu)水平研究β-半乳糖苷酶的耐熱機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DEAE-Sephrose Fast Flow、Sephadex G-75 瑞典Amersham Pharmacia公司；考馬斯亮藍(lán)、TEMED、聚丙烯酰銨 美國(guó)Amresco公司；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 上海生物工程公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng) 瑞典Aamersham Pharmacia Biotech公司；蛋白電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；CR21G II立式冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.2 菌種

β-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌株由本實(shí)驗(yàn)室從溫泉附近土壤中分離篩選得到。經(jīng)鑒定并命名為B a c i l l u s stearothermophilus XG24。

1.3 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件

接種適量的嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24菌懸液于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(乳糖2g、蛋白胨2g、CaCl20.01g、MgSO4·7H2O 0.001g、KH2PO40.1g、酵母浸膏0.2g、NaCl 0.015g、FeSO4·7H2O 0.001g、MnSO4·4H2O 0.001g、蒸餾水100mL)，pH6.8，45℃，150r/min培養(yǎng)42h。發(fā)酵培養(yǎng)物在4℃條件下8000r/min離心15min，去除細(xì)胞，上清液作為粗酶液進(jìn)行下面的分離純化操作。

1.4 酶的分離純化

將500mL粗酶液在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至40%飽和度，4℃靜置鹽析4h后8000r/min離心30min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至70%的飽和度，再次離心后收集沉淀，重新溶于30mL 20mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.5)中，并用相同的緩沖溶液徹底透析脫鹽。將上述經(jīng)透析脫鹽后的酶液，12000r/min離心30min后，上清液加到已用緩沖液A平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow (2.5cm×30cm)陰離子交換柱上，先用不含NaCl的緩沖溶液A洗脫，直到洗至A280nm在0.02以下時(shí)，再用0～1.0mol/L的NaCl進(jìn)行線性梯度洗脫。含酶組分合并后用聚乙二醇20000包埋法濃縮至2mL，再上Sephadex G-75(1.6cm×90cm)分子篩凝膠柱，用含0.02mol/L NaCl的20mmol/L磷酸緩沖溶液(pH6.5)進(jìn)行洗脫，收集有酶活性部分檢測(cè)酶純度及用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.5 酶活性測(cè)定

參考Gul-Guven等[11]的方法，并略有改動(dòng)。取500μL待測(cè)酶液加入到已經(jīng)預(yù)熱到65℃的1.5mL含有2mmol/L ONPG的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)中，65℃水浴保溫10min后，加入1mL 1mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算水解產(chǎn)物鄰硝基酚的含量和酶的活性，同時(shí)以0.1mol/L pH6.5磷酸緩沖液代替酶液作為對(duì)照。乳糖酶活性的定義：1個(gè)單位的乳糖酶的活性為在pH6.5，65℃條件下每分鐘分解ONPG生成lμmol鄰硝基酚(ONP)所需的酶量。

1.6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Lowry法[17]，以牛血清白蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。

1.7 分子質(zhì)量的測(cè)定

1.7.1 凝膠過(guò)濾法

藍(lán)色葡聚糖上樣Sephadex G-75凝膠色譜柱，測(cè)定柱空隙體積(V0)，然后上樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白及樣品蛋白，測(cè)定各蛋白的洗脫體積(Ve)，以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積同柱空隙體積的比率(Ve/V0)同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(lgMW)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出該β-半乳糖苷酶的表觀分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、兔肌動(dòng)蛋白、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.7.2 SDS-PAGE電泳

按Laemmli等[18]的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠10%，濃縮膠5%。將樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白(兔磷酸化酶B (97400D)、牛血清白蛋白(66200D)、兔肌動(dòng)蛋白

(43000D)、牛碳酸酐酶(31000D)、胰蛋白酶抑制劑(20100D)、雞蛋清溶菌酶(14400D))進(jìn)行SDS-PAGE，然后以相對(duì)遷移率對(duì)分子質(zhì)量作圖，從圖中求出該β-半乳糖苷酶的分子質(zhì)量。

1.8 β-半乳糖苷酶性質(zhì)研究

1.8.1 溫度和pH值的影響

將反應(yīng)體系分別置于30～85℃的水浴中進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定β-半乳糖苷酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶分別置于40、50、60、70、80℃的水浴中，每隔1h取樣測(cè)定殘余酶活力，用保存在4℃冰箱的相同酶液所測(cè)得的酶活性作為空白，設(shè)為100%，共測(cè)定4h。

純化后的β-半乳糖苷酶在不同pH4.0～10.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH值。測(cè)定pH值穩(wěn)定性是將酶液加入到100mmol/L的不同pH值緩沖液中，再于40℃保溫1h，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定剩余β-半乳糖苷酶的活性。所用緩沖液為：pH4.0～5.5的醋酸鈉緩沖液、pH6.0～7.5的磷酸鈉緩沖液、pH8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液、pH9.0～10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。以β-半乳糖苷酶在pH6.5時(shí)所測(cè)的酶活力為100%，其他pH值條件下所測(cè)為相對(duì)酶活力。

1.8.2 金屬離子的影響

取適當(dāng)稀釋的酶液，向其中分別加入用蒸餾水配制的金屬鹽溶液，40℃保溫1h后，標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活力。金屬鹽分別為：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnSO4、FeCl2、CoCl2、CuSO4、ZnSO4、AgNO3、HgCl2。

1.8.3 酶Km值的測(cè)定

在pH6.5、溫度65℃的條件下，分別將ONPG稀釋到終含量0～1%，測(cè)定β-半乳糖苷酶在不同底物濃度下的酶活力。根據(jù)Lineweaver-Burk方程，求此條件下的Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶分離與純化

圖1 DEAE-Sepharose FF離子交換層析Fig.1 DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatographic separation of thermostableβ-galactosidase

采用了硫酸銨分段鹽析、透析、DEAE-Sepharose fast flow離子交換層析、分子篩凝膠過(guò)濾層析等純化手段從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24發(fā)酵液中分離純化β-半乳糖苷酶。柱層析純化結(jié)果分別見(jiàn)圖1、2，純化的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 Sephadex G-75分子篩凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Sephadex G-75 gel filtration chromatographic purification of thermostableβ-galactosidase

圖3 β-半乳糖苷酶SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of thermostableβ-galactosidase at different separation and purification steps

硫酸銨分段鹽析顯示，在40%飽和度以下，沉淀蛋白中酶活性較弱，而上清液中檢測(cè)到較高的酶活性，在硫酸銨飽和度70%以上時(shí)，沉淀β-半乳糖苷酶活性較低。綜合考慮到酶的純化效率和回收率，選擇40%～70%飽和度的硫酸銨鹽析。沉淀后的粗酶蛋白溶解在磷酸緩沖液中，充分透析脫鹽及小分子的雜蛋白和色素。

徹底脫鹽后的粗酶液上樣經(jīng)過(guò)充分平衡的離子交換柱，NaCl線性梯度洗脫顯示，分離得到3個(gè)較大的蛋白主峰，收集管酶活性檢測(cè)到一個(gè)酶活性峰，主要在第二個(gè)蛋白峰的左側(cè)，所對(duì)應(yīng)的NaCl洗脫濃度為0.5mol/L。從洗脫曲線看出，離子交換層析效率較高，能夠去除大部分的雜蛋白，但酶活性峰的對(duì)應(yīng)位置沒(méi)有明顯清晰的蛋白峰，說(shuō)明酶液中含有雜蛋白。合并有酶活性的收集管，采用聚乙二醇2 0 0 0 0包埋法濃縮后，上樣Sephadex G-75凝膠柱，進(jìn)一步純化。凝膠柱層析洗脫曲線顯示3個(gè)清晰的蛋白峰，酶活性檢測(cè)到第一個(gè)蛋白

峰有極強(qiáng)的酶活性，而第二和第三個(gè)蛋白峰均沒(méi)有酶活性。合并有活性的收集管酶液，進(jìn)一步電泳檢測(cè)以及用于酶的性質(zhì)研究。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)酵液中的粗酶液經(jīng)以上純化步驟后，酶純度達(dá)到電泳均一，純化各步驟相應(yīng)的酶活性、蛋白濃度、產(chǎn)率和純化倍數(shù)見(jiàn)表1。

表1 β-半乳糖苷酶的分離純化Table 1 A summary of purification steps of thermostableβ-galactosidase fromB. stearothermophilusXG 24

由表1可知，酶純化了5 4.5倍，比活力達(dá)到32.7U/mg，產(chǎn)率為20.4%。采用一系列層析技術(shù)從不同的微生物發(fā)酵液中分離純化到β-半乳糖苷酶[11,19-20]，而本研究從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶并分離純化到電泳純的酶蛋白。

經(jīng)各步驟純化后的酶液SDS-PAGE電泳后硝酸銀染色結(jié)果如圖3所示。硫酸銨鹽析后的酶液電泳后有較多的雜蛋白存在，經(jīng)過(guò)離子交換層析后，雜蛋白明顯減少，最后分子篩凝膠過(guò)濾層析后，顯示單一的一條蛋白帶，表明純化后的酶蛋白達(dá)到電泳純，同標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白對(duì)照顯示純化到的β-半乳糖苷酶分子質(zhì)量約為64kD。通過(guò)Sephadex G-75色譜柱測(cè)定酶蛋白分子質(zhì)量為63.5kD。由此推斷，純化到的β-半乳糖苷酶含有一個(gè)蛋白亞基，表觀分子質(zhì)量為64kD。與所報(bào)道的嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)(50kD)[19]相似，但比來(lái)源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(120kD)[13]、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(530kD)[21]、嗜熱硫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)(240kD)[22]要小許多。故推測(cè)從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24中所純化到的β-半乳糖苷酶可能為一種新的β-半乳糖苷酶的同工酶。

2.2 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 β-半乳糖苷酶最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

如圖4所示，在溫度50～75℃的范圍內(nèi)所測(cè)β-半乳糖苷酶活力都在60%以上，最適反應(yīng)溫度為65℃。酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，酶在50℃保溫2h酶活力殘留92%，60℃保溫2h殘留在85%，70℃保溫2h殘留65%活力，80℃保溫2h殘留24%活力。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，比來(lái)源于嗜酸乳桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)[11]、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)[23]等菌株的β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性要高。同目前的研究報(bào)道相比較，從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24純化到的β-半乳糖苷酶是國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的β-半乳糖苷酶中耐熱性最強(qiáng)的酶之一。酶的耐熱性強(qiáng)在酶工業(yè)化應(yīng)用中具有很多優(yōu)勢(shì)，酶在高溫下處理樣品，可以抑制微生物的生長(zhǎng)[24]，防止乳制品雜菌污染。而且高溫下水解反應(yīng)速度快，時(shí)間短，可以大量地節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。目前，耐高溫β-半乳糖苷酶在乳制品加工業(yè)中備受關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on thermostableβ-galactosidase activity

圖5 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on thermostableβ-galactosidase stability

2.2.2 β-半乳糖苷酶最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對(duì)β-半乳糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on thermostableβ-galactosidase activity and stability

表2 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響Table 2 Effect of metal ions on thermostableβ-galactosidase activity

純化后的β-半乳糖苷酶在不同pH值的緩沖體系、65℃條件下測(cè)定的酶活性，結(jié)果如圖6所示，β-半乳糖苷酶在pH5.5～7.0之間酶活力在85%以上，最適作用pH值為6.5，同所報(bào)道的嗜熱球菌β-半乳糖苷酶最適pH值(pH6.0)[11]接近，但比源于棘孢曲霉的β-半乳糖苷酶最適pH值(pH5.4)[13]稍高。β-半乳糖苷酶在一系列不同pH值的緩沖液中40℃條件下處理1h后，再在最適pH值下測(cè)定酶活性，結(jié)果表明，在pH4.0～7.5之間保持90%以上的酶活性，而在pH7.5以上，酶活性則急速下降，表明β-半乳糖苷酶在弱酸性環(huán)境下非常穩(wěn)定。鑒于多數(shù)乳制品飲料的pH值也在這一范圍內(nèi)，故該酶的這些生化特性賦予了嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶乳制品加工中有極大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，因此該酶有著潛在的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

2.2.3 β-半乳糖苷酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

固定β-半乳糖苷酶的量，以不同濃度ONPG溶液為底物，測(cè)定酶反應(yīng)速度。采用Lineweaver-Burk作圖法，求得嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶對(duì)ONPG的Km為4.32mmol/L。同所報(bào)道的β-半乳糖苷酶相比較，如嗜熱球菌的Km為8.9mmol/L[11]、棲熱菌屬細(xì)菌(Thermus)的Km為5.9mmol/L[9]、嗜冷動(dòng)性球菌(Planococcus)的Km為9mmol/L[25]，嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶同底物ONPG的親和力較強(qiáng)。

2.2.4 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶的影響

在酶反應(yīng)液中分別加入不同的金屬離子使其終濃度為1mmol/L和10mmol/L。表2顯示：Cu2+、Ag+、Hg2+在所檢測(cè)范圍內(nèi)幾乎完全抑制酶的活性，Ca2+、Zn2+具有較弱的抑制活性。Na+、K+對(duì)酶活性的作用不明顯；Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+對(duì)酶活性均有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+、Mn2+在低濃度時(shí)激活作用更強(qiáng)，而Mg2+、Mn2+在高濃度時(shí)激活作用較強(qiáng)。

3 討 論

分離篩選極端環(huán)境下的一些產(chǎn)生極端生化特性酶的微生物菌株一直是研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室從溫泉附近土壤中分離篩選到一株產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的極端耐熱菌株。從菌株發(fā)酵液中分離純化到了電泳均一的β-半乳糖苷酶。純化步驟簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，大大減少酶的損失，回收率高。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，β-半乳糖苷酶最適作用pH值為6.5，溫度為65℃。同時(shí)具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，是典型的耐熱型β-半乳糖苷酶。這些生化特性賦予了該酶在乳制品加工中有極大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。酶活性長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，并具有較好的酶活力，保存相對(duì)比較容易，可以應(yīng)用于一般條件下的工業(yè)生產(chǎn)。也可以在溫度較高的環(huán)境下使用，因此，該極耐熱性β-半乳糖苷酶具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

本研究著重對(duì)酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并對(duì)其工業(yè)應(yīng)用前景進(jìn)行了探討和展望。但對(duì)該酶耐熱的分子機(jī)制研究還處于探索階段。對(duì)該酶的分子機(jī)制的更進(jìn)一步研究將有利于后續(xù)更多微生物極端酶的開(kāi)發(fā)和利用。

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Purification and Enzymatic Characterization of Thermostableβ-Galactosidase from Bacillus stearothermophilus XG24

GAO Zhao-jian，HOU Jin-hui，SUN Hui-gang，DIAO Jin-jin
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The fermentation supernatant of Bacillus stearothermophilus XG24 received salting out with ammonium sulfate, separation on DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange column and purification on Sephadex G-75 gel filtration column to obtain high-purity thermostable β-galactosidase, which was subsequently subjected to enzymatic characterization with o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside (ONPG) as a substrate. After the above separation and purification procedures, the purity of this enzyme showed a 54.5-fold increase, with an activity recovery of 20.4%, and the specific activity of the purified enzyme was 32.7 U/mg protein. The optimal pH and temperature for the reaction of this enzyme were 6.5 and 65 ℃, respectively. It was stable at temperatures below 70 ℃ or in a pH range between 4.0 and 8.0. Its activity was notably promoted by Mg2+, Mn2+, Fe2+and Co2+, whereas Cu2+, Ag+and Hg2+were almost able to entirely inhibit its activity. The Kmtowards ONPG was determined to be 4.32 mmol/L. The SDS-PAGE analysis revealed that this enzyme was a single-chain protein. Based on the results of Sephadex G-75 gel filtration chromatographic measurement, it was deduced that the apparent molecular weight of this enzyme was 64 kD. Therefore, Bacillus stearothermophilus XG24-derived thermostable β-galactosidase has high application potential in the dairy industry.

Bacillus stearothermophilus；β-galactosidase；purification；characterization

Q939.97

A

1002-6630(2010)23-0151-06

2010-03-21

徐州市博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

高兆建(1976—)，男，講師，博士，主要從事微生物次生代謝產(chǎn)物與基因工程。E-mail：gaozhaojian@126.com