甘 露，劉 婷，厙文波，張紅翠，鄭秋生，王振華*

(新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

4種新疆地產(chǎn)芳香植物精油抗氧化作用比較研究

甘 露，劉 婷，厙文波，張紅翠，鄭秋生，王振華*

(新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

采用體外研究方法比較新疆地產(chǎn)玫瑰、迷迭香、椒樣薄荷和羅馬甘菊4種芳香植物精油的抗氧化活性。測(cè)定4種精油對(duì)1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，同時(shí)用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定4種揮發(fā)油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明：4種精油均可清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基，并可抑制卵黃不飽和脂肪酸過(guò)氧化，且清除各類自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用與樣品揮發(fā)油質(zhì)量濃度正向相關(guān)。4種精油抗氧化活性順序?yàn)槊倒澹久缘悖窘窐颖『桑玖_馬甘菊。

新疆；玫瑰；迷迭香；椒樣薄荷；羅馬甘菊；精油；抗氧化

自由基過(guò)量引起的氧化還原失衡是許多疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)之一[1]。采用抗氧化劑對(duì)抗氧化應(yīng)激是維持機(jī)體健康的重要手段，眾所周知，植物中蘊(yùn)含著的抗氧化活性成分被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥和保健[2]。我國(guó)具有豐富的植物資源，因此，在眾多天然植物成分中，比較和篩選無(wú)毒副作用的具有良好效果的抗氧化劑，預(yù)防和緩解相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，是近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)[3]。新疆地區(qū)獨(dú)特的自然氣候條件孕育了大量?jī)?yōu)質(zhì)芳香植物資源，目前僅新疆伊犁地區(qū)就已種植了包括椒樣薄荷(Mentha piperita L.)、玫瑰(Rose rugosa thumb.)、迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)、羅馬甘菊(又名春黃菊，Chamaemelum nobile L.)、薰衣草(Lavandula angustifolia Mill.)等30余種芳香植物，種植面積超過(guò)10萬(wàn)畝。芳香植物種植和精油加工已經(jīng)成為新疆地區(qū)重要的特色產(chǎn)業(yè)之一。

椒樣薄荷(Mentha piperita L.) 為唇形科薄荷屬多年生宿根性草本植物，其精油主要含薄荷腦、薄荷酮、

薄荷烯、檸檬烯、蒎烯等化學(xué)成分，用于緩解神經(jīng)緊張，止痛、抗痙攣等[4]。玫瑰(Rose rugosa Thunb.)為薔薇科薔薇屬多年生常綠或落葉灌木，其精油主要含有蒎烯、檸檬烯、月桂烯、香茅醇、香葉醇、芳樟醇、橙花醇等化學(xué)成分，用于緩解脹痛、肝胃氣痛、解毒、穩(wěn)定情緒、抗抑郁、排毒養(yǎng)顏、緩解神經(jīng)性頭痛等[5]。迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)為唇形科迷迭香屬亞灌木或多年生草本植物，其精油主要含樟腦、龍腦、松油萜、桉葉素、蒎烯、檸檬烯等化學(xué)成分，用于收斂皮膚，提神醒腦，增強(qiáng)記憶力，抗感冒，止痛等[6]。羅馬甘菊(Chamaemelum nobile)為菊科黃春菊屬多年生草本植物，其精油主要含天藍(lán)烴、洋甘菊萜、樟腦萜、松油酮、蒎烯、桉葉素、月桂烯等化學(xué)成分，用于治療潰瘍、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、失眠、風(fēng)濕病等[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)在化學(xué)體系中觀察4種精油體外抗氧化活性，尋求其作為功能性抗氧化劑應(yīng)用的可能，為精油的綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰精油(rose oil)、迷迭香精油(rosemary oil)、椒樣薄荷精油(mentha oil)、羅馬甘菊精油(chamomile oil)均由新疆伊犁依帕爾汗香料發(fā)展有限責(zé)任公司提供，采用水蒸汽蒸餾工藝制備。

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、Tris堿、2-硫代巴比妥酸、焦性沒(méi)食子酸 美國(guó)Sigma公司。

本研究所用試劑均以Millipore Milli-Q超純水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

VARIOSKAN FLASH多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；AR-2140型萬(wàn)分之一電子天平 美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；Biocel型Millipore Mill-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基的清除活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]方法測(cè)定精油對(duì)DPPH自由基清除能力。于96孔酶標(biāo)板內(nèi)各孔加入100μL 的DPPH乙醇溶液(終濃度為0.06mmol/L)，再于各孔中分別加入100μL 含不同濃度精油的無(wú)水乙醇使總體積達(dá)到200μL，各種精油在反應(yīng)體系的終質(zhì)量濃度均為50、100、150、200、250mg/L?；靹颍覝?，避光放置30min后，以多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在517nm處吸光度，計(jì)算清除率。

式中：A0為DPPH溶液100μL +無(wú)水乙醇100μL 的吸光度；A1為DPPH溶液100μL +樣品溶液100μL 的吸光度；A2為樣品溶液100μL +無(wú)水乙醇100μL 的吸光度。公式中引入A2是為了消除樣品溶液本身顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。每次實(shí)驗(yàn)同一處理設(shè)3個(gè)平行孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值。

1.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定

精油對(duì)羥自由基清除能力測(cè)定采用鄰二氮菲法，方法如文獻(xiàn)[10]所述。于96孔酶標(biāo)板進(jìn)行如下測(cè)定?？瞻捉M：30μL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液中加入60μL 0.15mol/L的PBS (pH7.4)，加入30μL 的蒸餾水，充分混勻后，加入30μL 0.75mmol/L的硫酸亞鐵，混勻后，再加入30μL的1%的H2O2混勻。37℃的水浴中60min后，在536nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度為A1；空白對(duì)照組：以30μL 的蒸餾水代替H2O2重復(fù)上述操作，在536nm處，測(cè)定吸光度為A2；樣品組：以30μL 的待測(cè)樣品(反應(yīng)體系的終質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250mg/L)代替30μL 的蒸餾水重復(fù)損傷管組操作，在536nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度為A3；樣品對(duì)照組：60μL 0.15mol/L的PBS中加30μL 的樣品，充分混勻后，加入90μL 的蒸餾水，在536nm處測(cè)定吸光度為A4；空白參比組：60μL 0.15 mol/L的PBS加入120μL 的蒸餾水，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為A5。

每次實(shí)驗(yàn)同一處理設(shè)3個(gè)平行孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值。

1.3.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚法測(cè)定，方法如文獻(xiàn)[11]所述。反應(yīng)于96孔酶標(biāo)板進(jìn)行。取濃度為0.05mol/L的Tris-HCl(pH8.2)緩沖液100μL，25℃預(yù)熱20min，加入50μL不同濃度待測(cè)樣品溶液(待測(cè)樣品在反應(yīng)體系中的終質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250mg/L)，立即加入50μL 的3mmol/L的鄰苯三酚，振蕩使之充分反應(yīng)，4min后，用10μL的3mol/L的HCl終止反應(yīng)，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A1)，平行測(cè)定3次。模型對(duì)照組(A0)用50μL 的蒸餾水代替樣品液。空白對(duì)照組(A2)用40μL 的蒸餾水代替鄰苯三酚。計(jì)算超氧陰離子自由基清除率式。

每次實(shí)驗(yàn)同一處理設(shè)3個(gè)平行孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值。

1.3.4 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定

以TBA法測(cè)定待測(cè)揮發(fā)油對(duì)卵黃脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[12]。卵黃懸液的配制：新鮮雞蛋去卵清，卵黃用等體積的pH7.4的0.1mol/L PBS配成1:1懸液，并用磁力攪拌器攪拌10min，4℃冷藏備用，使用前用PBS稀釋成1:25的懸液。吸取1:25的卵黃懸液20μL，加入20μL 的不同質(zhì)量濃度待測(cè)精油溶液(反應(yīng)體系中的終質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 mg/L)，再加入20μL 的7.5mmol/L的FeSO4，用pH 7.4，0.1mol/L的PBS補(bǔ)至200μL，37℃振蕩15min，取出后再加入50μL 的體積分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸，5740×g離心8min，吸取上清液100μL，加入50μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的TBA溶液，封口，沸水浴中煮15min，在532nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。以不加樣品管的吸光度為A0，以樣品加PBS管的吸光度為A1。精油對(duì)卵黃脂質(zhì)過(guò)氧化按式(4)計(jì)算。

每次實(shí)驗(yàn)同一處理設(shè)3個(gè)平行孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次平均值。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均值比較。采用Microcal Origin 8.0軟件對(duì)各種精油量效關(guān)系進(jìn)行線性回歸后，計(jì)算各種精油抗氧化能力的半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.14 種精油清除DPPH能力比較

圖1 4種精油清除DPPH能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacities of essential oils from different plants

由圖1可知，4種精油均可清除DPPH自由基，且與質(zhì)量濃度正向相關(guān)。相同質(zhì)量濃度下，玫瑰精油的最高清除率為74.83%，明顯優(yōu)于羅馬甘菊、迷迭香和椒樣薄荷3種精油(P＜0.01)，而后三者相同質(zhì)量濃度間差別不大。采用線性回歸計(jì)算得到玫瑰精油、迷迭香精油、椒樣薄荷精油、羅馬甘菊精油清除DPPH自由基的IC50分別為75.5、199.2、228.0、239.2mg/L。

2.24 種精油清除羥自由基能力比較

圖2 4種精油清除羥自由基能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging capacities of essential oils from different plants

由圖2可知，4種精油均可清除羥自由基，且與質(zhì)量濃度正向相關(guān)。相同質(zhì)量濃度下，玫瑰精油作用明顯優(yōu)于其他3種精油(在100mg/L水平，P＜0.05；在50、150、200mg/L和250mg/L水平，P＜.01 )，迷迭香精油次之，椒樣薄荷精油和羅馬甘菊精油相差不大。玫瑰精油、迷迭香精油、椒樣薄荷精油和羅馬甘菊精油清除羥自由基的IC50分別為144.2、210.2、249.5、243.2mg/L。

2.34 種精油清除超氧陰離子自由基能力比較

圖3 4種精油清除超氧陰離子自由基能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging capacities of essential oils from different plants

由圖3可知，4種精油均可清除超氧陰離子自由基，且與精油質(zhì)量濃度正向相關(guān)，玫瑰精油和迷迭香精油清除超氧陰離子自由基能力相當(dāng)，IC50分別為142.7、145.0mg/L。椒樣薄荷精油和羅馬甘菊精油的清除能力稍弱。玫瑰精油、迷迭香精油、椒樣薄荷精油、羅馬甘菊精油清除超氧陰離子自由基的IC50分別為142.7、145.0、187.7、196.7mg/L。

2.44 種精油抑制卵黃脂質(zhì)過(guò)氧化能力比較

圖4 4種精油抑制卵黃脂質(zhì)過(guò)氧化能力Fig.4 Inhibitory effects of essential oils from different plants against the peroxidation of unsaturated fatty acids in egg yolk

由圖4可知，4種精油均能質(zhì)量濃度依賴性地抑制卵黃脂質(zhì)過(guò)氧化。玫瑰精油對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力優(yōu)于其他3種精油，250mg/L時(shí)最高抑制率可達(dá)91.66%；其他3種精油中迷迭香精油活性稍好，椒樣薄荷精油次之，最高抑制率分別為61.01%和59.58%；羅馬甘菊精油最弱，僅為58.62%。玫瑰精油、迷迭香精油、椒樣薄荷精油、羅馬甘菊精油抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的IC50分別為73.7、192.0、204.7、218.5mg/L。

3 結(jié) 論

3.1 新疆地產(chǎn)4種芳香植物揮發(fā)油均具有較強(qiáng)抗氧化活性，在50～250mg/L范圍內(nèi)，其抗氧化活性與質(zhì)量濃度正向相關(guān)。

3.24 種精油抗氧化能力從大到小依次為：玫瑰精油＞迷迭香精油＞椒樣薄荷精油＞羅馬甘菊精油，后兩者差別不大。

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Essential Oils from Four Species of Aromatic Plants Cultivated in Xinjiang: A Comparative Study of Antioxidant Effect

GAN Lu，LIU Ting，SHE Wen-bo，ZHANG Hong-cui，ZHENG Qiu-sheng，WANG Zhen-hua*
(Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832002, China)

The antioxidant effects of the essential oils from four species of aromatic plants cultivated in Xinjiang, Rose rugosa Thumb., Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. and Chamaemelum nobile L., were assessed and compared by measuring their DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging capacities and their inhibitory effect on lipid peroxidation in a triobarbituric acid (TBA) reaction system. The four essential oils were all able to scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals and inhibit the peroxidation of unsaturated fatty acids in egg yolk in a positive concentration-dependent fashion. Rose oil had the most excellent antioxidant activity, followed by rosemary oil, peppermint oil and roman chamomile oil.

Xinjiang；Rose rugosa Thumb.；Rosmarinus officinalis L.；Mentha piperita L.；Chamaemelum nobile L.；volatile oil；antioxidant

R962

A

1002-6630(2010)23-0036-04

2010-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760058)；新疆建設(shè)兵團(tuán)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2007JC03)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目(2007JC04)。

甘露(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿铀幚韺W(xué)。E-mail：lucille1985@sina.com

*通信作者：王振華(1973—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樽杂苫飳W(xué)與醫(yī)學(xué)。E-mail：zhenhuawang@tom.com