馬振剛 藍(lán)希鉗 周澤揚(yáng),2*

(1.西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400716;2.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶400047)

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展中,抗生素以其極佳的抗菌作用在細(xì)菌性疾病治療過程中占據(jù)了主要地位,它為人們治療微生物感染疾病提供了新的方向,為人類健康事業(yè)做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。但是隨著抗生素的大量應(yīng)用,細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和新生抗生素的篩選瓶頸使得抗生素的應(yīng)用受到一定的制約。近年來的研究發(fā)現(xiàn),抗菌肽(Antimicrobal peptides,AMPs)以其獨(dú)特的作用機(jī)理和分子特性成為抗生素最為理想的替代藥物。

抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的短肽免疫效應(yīng)因子,在生物機(jī)體的先天免疫中起著重要的作用。自從1980年瑞典科學(xué)家Boman等人從惜古比天蠶(Hyalophora cecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到殺菌肽天蠶素(Cecropin)以來[2],在昆蟲中已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了200多種抗菌肽[3]?？咕姆肿恿啃?一般含6～60個(gè)氨基酸殘基。蠶類抗菌肽是指那些存在于蠶體及蠶蛹的血淋巴等免疫系統(tǒng)中,具有高效殺菌活性的肽類物質(zhì),具有抗菌譜廣、分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)。它成為昆蟲高效的先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,增強(qiáng)了蠶自身對(duì)病原微生物的抵抗力,減少了蠶類病原疾病的發(fā)生[4]。經(jīng)過最近二十幾年的研究顯示,抗菌肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌[5]有廣譜的抗菌活性,對(duì)病毒、原蟲[6]也有作用。

1 蠶類抗菌肽的家族分類

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,2006年中國蠶絲業(yè)生產(chǎn)價(jià)值達(dá)到1.77千萬美元[7]。由于家蠶容易飼養(yǎng),可利用的突變體多等特點(diǎn)使之成為繼果蠅之后的昆蟲遺傳學(xué)研究的模式生物。2003年家蠶基因組序列測(cè)序已經(jīng)完成[8];2007年,高精度的家蠶基因組數(shù)據(jù)得以誕生,夏慶友等人預(yù)測(cè)其基因數(shù)目大約為14,623個(gè)。2006年Tingcai Cheng等人[9]利用家蠶基因數(shù)據(jù)庫本地Blast鑒定了35個(gè)與其它昆蟲抗菌肽相似的氨基酸序列:包括Cecropins、Enbocins、Attacins、Moricins、Gloverins、和Lebocins等家族成員。2008年Wen等[10]進(jìn)行了家蠶De-fensin-like1(BmdefA)基因的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式的研究,鑒定出一個(gè)Defensin-like(BmdefA)基因。同年Yoichi Kaneko等人[11]從家蠶脂肪體中克隆得到了脂肪體組織特異性表達(dá)的Defensin-like2(BmdefB)基因。至此家蠶抗菌肽Defensin家族成員也被成功鑒定。

1.1 Moricins家族

家蠶抗菌肽Moricin是由Seiich Hara等人[12]于1995年首先發(fā)現(xiàn)的,是他們?cè)谘芯考倚Q血淋巴抗金黃色葡萄球菌的抗菌活性時(shí)分離得到的一種新型抗菌肽。此類抗菌肽可分為兩類,分別命名為Moricin1和Moricin2,它們的區(qū)別在于信號(hào)肽的第6位氨基酸殘基,Moricin1是Phe,Moricin2是Lys,相似度高達(dá)97.2%,成熟肽是完全相同的。用大腸桿菌注射家蠶幼蟲,在脂肪體、馬氏管組織中能觀察到Moricin基因表達(dá),而在絲腺、中腸沒有檢測(cè)到表達(dá)[11]。2006年,Tingcai Cheng等人[9]通過對(duì)家蠶數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽Moricins家族有12個(gè)成員,并將其分為家族A和B。家蠶Moricins前體包含65或66個(gè)氨基酸殘基,前22或23個(gè)氨基酸殘基是預(yù)測(cè)的信號(hào)肽,成熟肽有42個(gè)氨基酸殘基,具有強(qiáng)堿性,帶正電荷,等電點(diǎn)比天蠶素高,分子的N端每隔3～4個(gè)氨基酸殘基就有一個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(圖1a),C端富含堿性氨基酸殘基[13]?？咕腗oricins對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)的抗菌活性,用細(xì)菌脂多糖(LPS)能誘導(dǎo)家蠶Moricins的產(chǎn)生,說明Moricins的靶標(biāo)是細(xì)菌的膜部分[14],進(jìn)一步研究表明Moricins是通過增加膜的通透性而達(dá)到殺菌的作用。目前在其他昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了與家蠶Moricins相似性很高的類似抗菌肽[15],抗菌肽Moricins在不同種昆蟲中高度保守,推測(cè)其在進(jìn)化中具有重要地位。

圖1 家蠶抗菌肽氨基酸序列

1.2 Cecropins家族

1980年,Boman等從Hyalophora cecropia中首次分離出Cecropin。天蠶素廣泛存在于昆蟲中,目前人們已經(jīng)在鱗翅目的蛾類、蝴蝶及雙翅目的蠅類中純化出Cecropin。Cecropins由約40個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為4kDa,并且具有熱穩(wěn)定性。目前為止,家蠶Cecropin A、B、D、E都已經(jīng)有了研究報(bào)道[16-19],它們包含有2個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu),N-端富含親水氨基酸殘基,C-端富含疏水氨基酸殘基,主要是抗革蘭氏陰性菌,在細(xì)菌膜上形成離子通道引起菌體內(nèi)容物外流,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[20]。

1.3 Lebocins家族

Lebocins家族富含脯氨酸,由32個(gè)氨基酸殘基組成[21],第15(15-Thr)位是一個(gè)糖基化位點(diǎn)(圖1d),有利于提高抗菌肽活性。Lebocins的結(jié)構(gòu)和抗菌特征與蜜蜂的抗菌肽Abaecin相同。目前有3個(gè)Lebocins(Lebocin 1、2、3)得到分離,Lebocin 1和2氨基酸序列高度相似,Lebocin 4已被克隆,它與其它3個(gè)Lebocin高度相似。Lebocins在生理?xiàng)l件下抗菌活性很低,但是當(dāng)有Cecropin D或糖存在時(shí)能大大的增加其抗菌活性。在家蠶中,Cheng等[9]只鑒定到1個(gè)Lebocin,推測(cè)其它成員可能定位在家蠶基因組序列的gaps上。

1.4 Gloverins家族

Gloverins家族富含甘氨酸,且甘氨酸位置高度保守,不含有半胱氨酸,熱穩(wěn)定性好,能與脂多糖(LPS)相互作用,并特異的抑制菌體細(xì)胞壁形成,引起膜通透性增加,最終導(dǎo)致菌體緩慢生長甚至死亡。2006年7個(gè)Gloverin基因被Cheng等[9]在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中得以分析鑒定。

1.5 Attacins家族

抗菌肽Attacins富含甘氨酸,分子量約為20kDa,無半胱氨酸。昆蟲Attacin按其等電點(diǎn)的不同可以劃分為兩大類:堿性攻擊素和酸性攻擊素。經(jīng)過大量研究表明,Attacin與天蠶素(Cecropin)、防御素(Defensin)以及溶菌酶(Lysozyme)共同構(gòu)成了昆蟲非特異性先天免疫系統(tǒng)的主體[20]。2006年Cheng等[9]鑒定了2個(gè)家蠶Attacins基因,它們位于同一個(gè)scaffold上,與果蠅的Attacin基因相似。Attacin主要是對(duì)革蘭氏陰性菌起作用,抑制菌體外膜蛋白的合成達(dá)到殺菌的目的。

1.6 Defensin家族

Defensin家族抗菌肽分子量約4kDa左右,由約34-43個(gè)氨基酸殘基組成,富含半胱氨酸,主要對(duì)革蘭氏陽性菌起作用。2008年Wen等[10]通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和表達(dá)序列標(biāo)簽分析,獲得了一個(gè)Defensin-like(BmdefA)基因,該基因的開放閱讀框編碼了一個(gè)含有22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,一個(gè)34個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽和一個(gè)36個(gè)氨基酸殘基的成熟肽,其成熟肽分子量約為4.0kDa;成熟肽包含了昆蟲Defensin共有的6個(gè)半胱氨酸基序,其理論等電點(diǎn)為4.12,因此我們推測(cè)這是一個(gè)新型陰離子抗菌肽。2008年Yoichi Kaneko[11]等人從家蠶脂肪體cDNA文庫中克隆獲得了Defensin-like2(BmdefB)基因,該基因編碼的抗菌肽能在蠶體受到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及真菌的誘導(dǎo)下大量的表達(dá)。雖然BmdefB同樣具有由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基構(gòu)成的基序,但是它與BmdefA的氨基酸序列相似性只有27%(圖1c),且它是一種陽離子抗菌肽,推測(cè)它們可能來自不同的祖先[22]。

1.7 Enbocins家族

1998年Sang等[30]利用探針雜交法獲得了Enbocin基因,氨基酸序列與Cecropin家族類似,但是卻表現(xiàn)出不同的抑菌活性,Cecropins對(duì)抗革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑菌活性,而Enbocin對(duì)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用。2006年Cheng等[9]鑒定了2個(gè)家蠶Enbocin基因,其成熟肽氨基酸序列相似性極高(圖1b),基因染色體定位表明它們成簇的排列在同一條染色體上[22]。

2 蠶類抗菌肽的異源表達(dá)系統(tǒng)

2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

為獲得較純的抗菌肽樣品,同時(shí)為抗菌肽批量生產(chǎn),對(duì)抗菌肽異源表達(dá)的研究十分迫切且具有應(yīng)用意義。由于抗菌肽分子中存在堿性氨基酸殘基,因此蛋白酶對(duì)其影響顯著。同時(shí),表達(dá)的抗菌肽對(duì)表達(dá)宿主菌具有抑制和殺傷作用,使得抗菌肽的異源表達(dá)量不高。目前,解決這一難題的方法有基因的串聯(lián)表達(dá)策略以及基因的融合表達(dá)策略,而研究者們主要采用抗菌肽的融合表達(dá)策略來解決抗菌肽在異源表達(dá)系統(tǒng)中遇到的問題,該方法是將抗菌肽基因與一個(gè)編碼較大蛋白質(zhì)分子的基因融合在一起共表達(dá),較大的蛋白質(zhì)分子能夠與抗菌肽本身的堿性氨基酸中和,并且暫時(shí)影響抗菌肽分子構(gòu)象,導(dǎo)致抗菌肽的殺菌活性下降,從而降低對(duì)宿主菌的殺傷作用;同時(shí)也增強(qiáng)了抗菌肽分子穩(wěn)定性,防止其被酶解。待獲得純凈的融合表達(dá)蛋白后,采用酶切或者化學(xué)剪切作用切除大分子標(biāo)簽,使抗菌肽分子恢復(fù)應(yīng)有構(gòu)象,并重新獲得較強(qiáng)的抑菌活性[23]。由于原核表達(dá)操作簡便(如圖2A),亦能獲得活性肽,許多研究者都采用此系統(tǒng)研究抗菌肽的異源表達(dá)。目前成功的融合表達(dá)系統(tǒng)主要有GST系統(tǒng)、β-半乳糖苷酶系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)系統(tǒng)等;純化標(biāo)簽融合表達(dá)也有一定的應(yīng)用,如His-tag、FLAG-tag和HA-tag等[24]。

1998年Seiichi Hara等[25]將Moricin基因克隆至原核表達(dá)載體pXa1 and pMAL-c2中,在大腸桿菌中成功表達(dá)具有抑菌活性的目的蛋白。2008年趙巖龍等[26]將家蠶抗菌肽Moricin基因與表達(dá)載體pET-32M連接,在大腸桿菌中融合表達(dá),成功純化出目的蛋白,并證明其對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性;2008年韓晉輝等[27]根據(jù)天蠶素特征,設(shè)計(jì)了4條抗菌肽,將設(shè)計(jì)抗菌肽的基因克隆到載體pUC19上,在大腸桿菌JM109中融合表達(dá)目的多肽,抑菌圈法測(cè)定其抗菌活性,結(jié)果表明其中抗菌肽AMP-Cec具有較強(qiáng)的抑菌活性。

圖2 蠶類抗菌肽異源表達(dá)流程

2.2 真核酵母表達(dá)系統(tǒng)

目前發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類繁多,來源廣泛,其中真核生物抗菌肽占很大比重。由于原核異源表達(dá)系統(tǒng)缺乏對(duì)表達(dá)蛋白的加工與修飾,因此真核生物抗菌肽在其中表達(dá)往往活性較低或無活性。酵母表達(dá)體系是目前抗菌肽基因和生物工程中重要且應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)體系之一,該表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn):1能夠直接表達(dá)小分子肽;2具有外源蛋白的加工與修飾系統(tǒng);3基因操作相對(duì)簡單(如圖2B);4產(chǎn)物的表達(dá)量高、易大量發(fā)酵培養(yǎng)和易純化。因此在昆蟲抗菌肽表達(dá)研究方面有著重要的應(yīng)用。在現(xiàn)今的真核酵母表達(dá)系統(tǒng)中,常用的表達(dá)載體有pPICZα A、pGAPZα A和pPIC9K,由于其具有分泌蛋白的引導(dǎo)肽且能加工切除重組蛋白的信號(hào)肽,因此表達(dá)的目的蛋白能夠分泌到細(xì)胞外,從而避免酵母內(nèi)源蛋白酶對(duì)其降解,同時(shí)還便于后續(xù)純化目的蛋白,這些優(yōu)點(diǎn)使得酵母表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛的應(yīng)用。

2008年王秀青,張素芳等[28]亞克隆Cecropin B并將3個(gè)亞克隆串聯(lián)在一起,將串聯(lián)體克隆至表達(dá)載體pPICZα A上,電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168,甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白具有明顯的抑菌活性。2009年王秀青,朱明星等[29]設(shè)計(jì)引物對(duì)前期構(gòu)建成功的載體天蠶素類雜合肽CecropinA-magainin進(jìn)行定點(diǎn)突變,使其生成雜合肽的衍生物,測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化畢赤酵母受體細(xì)胞SMD1168,甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,活性試驗(yàn)表明其對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌活性。

2.3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

在抗菌肽的異源表達(dá)的研究過程中,針對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基組成的特點(diǎn),選擇不同的異源表達(dá)體系,除了眾多研究者采用的原核表達(dá)體系和真核酵母表達(dá)體系外,Sang等[30]于1998年用昆蟲細(xì)胞表達(dá)了具有抑菌活性的家蠶抗菌肽Enbocin,其將家蠶Enbocin基因克隆至表達(dá)載體pBacPAK9中,構(gòu)建重組桿狀病毒并轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞,培養(yǎng)4天后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清,通過抑菌圈試驗(yàn)證實(shí)其能抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。截止到目前,由于細(xì)胞水平表達(dá)抗菌肽成本高且對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求嚴(yán)格,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)并沒有得到廣泛的應(yīng)用。

3 蠶類抗菌肽異源表達(dá)研究現(xiàn)狀

過去幾年對(duì)蠶類抗菌肽的研究,以抗菌肽基因分析、肽結(jié)構(gòu)解析和天然抗菌肽的獲取[31-33]為主要方向。由于天然抗菌肽表達(dá)量低、提取過程復(fù)雜等原因,使得對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)解析與作用機(jī)理的研究受到阻礙[34]。近年來,異源表達(dá)重組抗菌肽的研究逐漸增多,而各家族成員基因表達(dá)現(xiàn)狀具體見表1。從總體上來看,對(duì)蠶類抗菌肽異源表達(dá)的研究進(jìn)展處于剛剛起步階段,其相關(guān)報(bào)道遠(yuǎn)少于家蠅等其他物種,如Attacin、Defensin與Lebocin等家族的異源表達(dá)研究仍無文獻(xiàn)報(bào)道。由于蠶類抗菌肽基因?qū)儆谡婧松锘?原始表達(dá)的抗菌肽可能經(jīng)過真核系統(tǒng)的修飾與加工,但現(xiàn)今大多數(shù)研究采用原核異源表達(dá)體系,如Moricin[25]與Gloverin[35]家族,著重研究其原核表達(dá)體系,真正獲得的重組抗菌肽活性均低于天然抗菌肽活性,且降低了獲得生物活性肽的幾率;加之原核融合表達(dá)產(chǎn)量低,不符合工業(yè)開發(fā)的要求。在真核表達(dá)過程中,酵母表達(dá)體系以其自身優(yōu)勢(shì)更適合工業(yè)開發(fā)與生產(chǎn),家蠅抗菌肽真核異源表達(dá)系統(tǒng)研究已經(jīng)深入所有家族,但現(xiàn)今蠶類抗菌肽中只有Cecropin家族有相關(guān)報(bào)道[28-29],因此,蠶類抗菌肽真核異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用更值得關(guān)注。

表1 蠶類抗菌肽異源表達(dá)情況

4 應(yīng)用與展望

蠶類抗菌肽是蠶體對(duì)外界病原物侵染而產(chǎn)生的先天免疫產(chǎn)物,其自身具備的特點(diǎn)使它在醫(yī)藥、植物抗病、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等方面得到應(yīng)用。

4.1 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

雖然抗生素的出現(xiàn)為人類的健康做出了許多貢獻(xiàn),但是隨著抗生物的大量使用導(dǎo)致了許多耐藥病原菌的產(chǎn)生;并且抗生素的使用對(duì)生物機(jī)體有害,因?yàn)樗艽碳?nèi)毒素的釋放,有時(shí)還會(huì)造成膿毒休克。抗菌肽在使用時(shí)就無此現(xiàn)象發(fā)生,且它能抑制細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)人體有害的細(xì)胞因子;抗菌肽具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理,它通過對(duì)細(xì)胞膜的物理化學(xué)損傷使細(xì)胞破裂,或者抑制細(xì)胞壁的呼吸而達(dá)到抑制細(xì)菌繁殖的效果。趙東紅等[36]在掃描電鏡下觀察到家蠶抗菌肽CM4對(duì)離體U937、Hela癌細(xì)胞骨架及核骨架有明顯損傷作用。柞蠶抗菌肽能抑制乙型肝炎病毒DNA復(fù)制,又能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞,對(duì)動(dòng)物安全、無毒副作用,在醫(yī)藥上已制成“腎肝寧”膠囊治療腎炎及肝炎[37]。

4.2 在植物抗病方面的應(yīng)用

1998年,張祥喜等人研究發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽能夠抑制花生青枯病,且花生青枯病病菌的生長速率與家蠶抗菌肽濃度對(duì)數(shù)值間呈負(fù)相關(guān)[38]。2008年李波等[39]討論了抗菌肽Cecropin及其在轉(zhuǎn)基因植物抗菌中的應(yīng)用,闡述了轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)Cecropin抗菌肽具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和實(shí)用價(jià)值。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程,如轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻等,把特異的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物,產(chǎn)生抗病新品種,使其自身抵制病蟲害的能力增強(qiáng),從而能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的投用,減少了對(duì)自然環(huán)境的危害,也為人們提供了健康的綠色食品。

4.3 在食品工業(yè)方面的應(yīng)用

目前我國使用的食品防腐劑多以苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對(duì)羥基苯甲酸脂類等化學(xué)合成劑為主,這些防腐劑在食品加工中的添加量都較大,容易超標(biāo)而危害人體健康;蠶類抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好和水溶性好等特點(diǎn),將它作為食物加工及保存的添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景[40]?？咕脑谑称钒l(fā)酵方面也有重要的應(yīng)用,它能用于防止食品發(fā)酵過程中的雜菌污染,除了直接添加這類肽以外,還可以把抗性基因轉(zhuǎn)入發(fā)酵菌株,讓發(fā)酵菌株表達(dá)這類抗菌肽以防止雜菌污染。

4.4 在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用

抗菌肽在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在抗菌肽作為飼料添加劑。目前,抗生素應(yīng)用導(dǎo)致大量抗性菌產(chǎn)生,使得抗生素在此領(lǐng)域的應(yīng)用受到質(zhì)疑。而蠶類抗菌肽作為一種廣譜、高效、綠色的新型抗生素,其應(yīng)用已初現(xiàn)雛形。2010年陳冰等[41]在對(duì)蝦飼料中添加家蠅幼蟲抗菌肽提取物,添食實(shí)驗(yàn)說明飼料中添加適量的家蠅抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦有一定的促生長作用,并能提高對(duì)蝦的免疫相關(guān)指標(biāo)。

目前,蠶類抗菌肽還處在試驗(yàn)和應(yīng)用推廣階段,成熟可靠的研究成果將有助于蠶類抗菌肽的實(shí)用化。作為新世紀(jì)抗生素取代藥物之一,綠色、高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)將使抗菌肽類產(chǎn)品具有巨大的應(yīng)用潛力。而家蠶絲綢產(chǎn)業(yè)作為中國重要進(jìn)出口產(chǎn)業(yè)之一,蠶類抗菌肽的應(yīng)用也將受到其積極的影響,在新世紀(jì)絲綢之路愈加輝煌的過程中,蠶類抗菌肽藥物也必將倍受重視,在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、食品業(yè)等領(lǐng)域作出巨大的貢獻(xiàn)。

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