肖小平, 周天鴻, 宮君原, 楊丹麗, 員月明, 李月琴, 鄒 奕, 張 欣, 李弘劍

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系,廣東廣州 510632)

人巨細(xì)胞病毒 (human cytomegalovirus,HCMV)是一種重要的條件致病病原體,屬皰疹病毒科乙組皰疹亞科,為雙鏈 DNA病毒,在人群中感染非常普遍,為常見人體感染病毒,多數(shù)可長期帶毒成為潛伏感染者[1]。在新生兒[2]、器官移植、腫瘤、艾滋病等免疫低下人群中,HCMV疾病的發(fā)病率和病死率都很高,是器官移植失敗和受體死亡的重要原因[3-5]。HCMV病毒顆粒由至少 40種蛋白組成,包含包膜蛋白(envelope),皮層蛋白 (tegument),核衣殼 (capsid)[6]。皮層蛋白參與病毒顆粒的形成[7,8]、病毒運輸[9]、免疫調(diào)節(jié)[10-12]以及轉(zhuǎn)錄激活過程。對編碼皮層蛋白的基因進(jìn)行無義突變,研究重組病毒的表型,發(fā)現(xiàn)有些皮層蛋白對于病毒復(fù)制或者高效復(fù)制是必須的。也有些基因?qū)τ诓《驹隗w外復(fù)制是非必須的[13-15]。UL23是病毒的非必須基因,美國加州大學(xué)柏克利分校 (Berkeley)L IU實驗室在研究人巨細(xì)胞病毒 Towne病毒株基因組功能時,發(fā)現(xiàn)缺失UL23的病毒株的生長能力比野生型強(qiáng) 10倍左右,作者推測,UL23可能作為一個生長抑制因子起作用。這些抑制因子可能會限制或阻止病毒的復(fù)制水平,使其不會嚴(yán)重破壞組織或使宿主死亡,而且,它們可能也會抑制裂解性復(fù)制至低水平或者停止復(fù)制,這樣, HCMV才能持續(xù)、潛伏感染[15]。

目前對UL23的了解僅限于知道UL23可以編碼蛋白質(zhì) pUL23,是病毒的 tegument蛋白,在細(xì)胞內(nèi)大致定位在核周邊[16]。本文從研究與 pUL23相互作用的宿主蛋白入手,篩選能與 pUL23相互作用的宿主蛋白,為進(jìn)一步闡明 pUL23發(fā)揮功能的分子機(jī)制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

Towne病毒株、質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)、質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)、pGEX-4T1、原核表達(dá)菌BL21、HFF細(xì)胞、COS7細(xì)胞均為本實驗保存。Matchmaker GAL4 yeast two-hybrid system 3和人胚腎 cDNA文庫均購自 Clontech;glutathione-Sepharose beads購自 Novagen;protein G Plus/protein A agarose suspension購自Invitrogen;HA鼠單克隆抗體購自美津公司;FLAG兔多克隆抗體購自北京西美杰公司;polyfect transfection reagent轉(zhuǎn)染試劑購自 Qiagen;酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒均購自 Omega;一步法 RT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶均購自 TaKaRa。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔Ⅱ抗、Cy3標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗均購自西美杰公司;R IPA裂解液、PMSF購自碧云天公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;PVDF膜購自Bio-Rad。

2 質(zhì)粒構(gòu)建

2.1 原核表達(dá)載體 pGEX-4T1-IGFBP4的構(gòu)建以人胚腎 cDNA文庫質(zhì)粒為模板,根據(jù) GenBank上公布的 IGFBP4序列(RefSeq號:NM_001552),采用軟件Primer Premier 5.0分析,設(shè)計 IGFBP4上、下游引物。P1:5’-AGGAATTCGCCACCATG ACCCAG AATCTGGGG AGTGA-3’;P2:5’-GGGCTCG AGGGCTGGTCCTAGGCCTCCTGTTC-3’。PCR方法擴(kuò)增IGFB P4的 CDS,下劃線分別代表 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點,PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物,進(jìn)行 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切,使用純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物,與經(jīng)過 EcoRⅠ和 XhoⅠ酶切的pGEX-4T1連接,轉(zhuǎn)化 E.coliDH5α感受態(tài)中, pGEX-4T1-IGFBP4重組子經(jīng) PCR鑒定、酶切鑒定成功后,將此送往華大基因科技有限公司測序。

2.2 構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-FLAG-UL23 FLAG標(biāo)簽序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列為:5’-GATCCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGTGAT-3’;互補(bǔ)鏈:5’-CTAGATCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCG-3’。下劃線為 SalⅠ、XbaⅠ黏性末端,使用前應(yīng)退火。以 EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切 pGBKT7-UL23,使用純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。UL23片段以 GenBank上公布的 tegument protein UL23[human herpesvirus 5](RefSeq號為 NC_006273)序列為模板,使用軟件Primer Premier 5.0分析,設(shè)計 PCR上、下游引物 P1、P2。P1:5’-AAGG AATTCCGGATGTCGGTAATCAAG GAC -3;P2:5’-AACGTCG ACCGCGTCGTCAAAAAGTTGGTG-3’。Towne感染 HFF細(xì)胞 96 h后,收集細(xì)胞用 Trizol提取總 RNA,采用一步法 RTPCR試劑盒 PCR擴(kuò)增UL23基因的ORF序列,條件: 95℃預(yù)變性 5 min,95℃ 30s,54℃ 30 s,72℃ 1 min,30個循環(huán),72℃10 min,4℃保存 10 min。下劃線分別代表 EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點。PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物,進(jìn)行 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切,使用純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物,以EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切載體 pcDNA3.1(+),膠回收大片段,將 FLAG標(biāo)簽序列、UL23PCR片段、酶切后的pcDNA3.1(+)3種片段再經(jīng) T4 DNA連接酶在16℃連接,16-30 h后將得到的連接液,轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)中,pcDNA3.1(+)-FLAG-UL23轉(zhuǎn)化子經(jīng) PCR鑒定、酶切鑒定成功后,將此送往華大基因科技有限公司測序。

2.3 構(gòu)建真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(-)-UL23-HA HA標(biāo)簽序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列為:5’-GATCC T ACCCATACG ATGTTCCAG ATTACGCTTGG-3’,互補(bǔ)鏈 5’-TCGACCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAG-3,下劃線為 SalⅠ、BamHⅠ黏性末端,使用前應(yīng)退火。UL23構(gòu)建方法同 2.2操作,使用純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物 UL23片段;pcDNA3.1(-)載體使用 EcoRⅠ和 B amHⅠ雙酶切,使用純化試劑盒回收目的產(chǎn)物 pcDNA3.1(-)。將 HA標(biāo)簽序列、回收UL23片段、酶切后的 pcDNA3.1(-)載體三者再經(jīng) T4 DNA連接酶在 16℃連接,16-30 h后將得到的連接液轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)中,pcDNA3.1(-)-UL23-HA轉(zhuǎn)化子經(jīng) PCR鑒定、酶切鑒定成功后,將此送往華大基因科技有限公司測序。

2.4 構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG 使用人工合成的 FLAG片段 (見方法 2.2),pGEX-4T1 -IGFBP4用 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切,膠回收 IGFBP4片段,以 EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切載體 pcDNA3.1(+),膠回收大片段,將 FLAG片段、IGFBP4片段、雙酶切載體pcDNA3.1(+)3種片段再經(jīng) T4DNA連接酶在16℃連接,16-30h后將得到的連接液,轉(zhuǎn)化入DH5ɑ感受態(tài)中,pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG轉(zhuǎn)化子經(jīng) PCR鑒定、酶切鑒定成功后,將此送往華大基因科技有限公司測序。

2.5 COS-7細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng) COS-7細(xì)胞于6孔板中,3 mL 10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(1 ×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達(dá)到 80%-90%時,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法按照 polyfect transfection reagent說明書。轉(zhuǎn)染 48 h后,每孔加入 R IPA弱裂解液150μL,1 mmol/LP MSF,冰上裂解細(xì)胞 10 min,使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到一個預(yù)冷的 EP管,4℃、10 000 r/min離心 10 min,收集上清,準(zhǔn)備做 GST-pull down和免疫共沉淀實驗。

2.6 GST-pull down實驗 將 pGEX-4T1、pGEX -4T1-IGFBP4分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21,用0.8 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá) 4 h,10 000×g離心 5 min、棄廢液,收集菌體,使用 binding/wash buffer [2 mmol/L KH2PO4,4.2 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L KCl,140 mmol/L NaCl,1%Triton X-100(V/V), 1 mmol/L P MSF]重懸并進(jìn)行超聲破碎,10 000 r/min, 4℃離心 20 min,取上清,各加入 20μL glutathione-Sepharose beads(谷胱甘肽瓊脂糖珠),混勻,搖床上4℃孵育 30 min,用 binding/wash buffer洗滌 3次,每次 4℃離心 5 min。培養(yǎng) COS-7細(xì)胞,pcDNA3.1 (-)-UL23-HA轉(zhuǎn)染 COS-7細(xì)胞,收集裂解細(xì)胞上清,加入純化好的蛋白,4℃孵育 3 h,2 000 r/min離心 5 min,收集瓊脂糖珠,用 binding/wash buffer洗滌 3次,然后加 4×SDS上樣緩沖液,沸水煮 5 min,取20μL進(jìn)行 SDS-PAGE膠電泳,用半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,在含 5%脫脂牛奶的 PBST封閉液中室溫封閉 1 h,Ⅰ抗為 FLAG抗體,Ⅱ抗為 HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體,4℃振蕩 50 min后,用 PBST漂洗4次,每次 15 min,而后加底物 ECL并于暗房進(jìn)行 X光膠片的顯影、定影。

2.7 免疫共沉淀實驗 按照如上的方法將 pcDNA3.1(-)-UL23-HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4 -FLAG轉(zhuǎn)入 COS-7細(xì)胞,分單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)。細(xì)胞裂解上清加入兔抗 FLAG多克隆抗體,4℃孵育 12 h,分別加入 protein G Plus/protein A agarose suspension各 20μL,混勻,搖床上 4℃孵育 3 h,2 000 r/min 4℃離心5 min,去上清,用1%Triton X-100(V/V)細(xì)胞裂解緩沖液洗滌 5次。然后加 4×SDS上樣緩沖液,沸水煮 5 min,取 20μL進(jìn)行 SDS-PAGE膠電泳,用半干法轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上,在含 5%脫脂牛奶的 PBST封閉液中室溫封閉 1 h,分別用 HA、FLAG為Ⅰ抗做免疫印跡檢測。

結(jié) 果

1 GST-pull-down確認(rèn) pUL23與 IGFBP4之間的相互作用

我們在實驗中采用 pUL23作為誘餌蛋白,從人胚腎篩選到 79個陽性克隆[17]。經(jīng)過進(jìn)一步鑒定以及將測序結(jié)果在 GenBank上進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)宿主蛋白 IGFBP4(insulin-like growth factor binding protein 4,NM_001552)能與 pUL23蛋白相互作用。為了確定 pUL23與 IGFBP4之間的是否具有物理性相互作用,采用 GST-pull-down實驗進(jìn)行驗證。重組質(zhì)粒測序結(jié)果明,pcDNA3.1(+)-UL23-FLAG、pGEX-4T1-IGFBP4重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。在大腸桿菌中用 IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá) GST和 GST-IGFBP4,并通過谷胱甘肽瓊脂糖珠純化,結(jié)果如圖 1A所示,GST蛋白 (28 kD,圖 1A)及 GST-IGFBP4 (53kD,圖 1A)純化效果很好。將純化好的 GST、GST-IGFBP4融合蛋白分別與在 COS7細(xì)胞中表達(dá)的UL23-FLAG蛋白上清混合、冰上孵育 3 h,然后2 000 r/min離心 5 min,收集瓊脂糖珠,最后用 FLAG抗體檢測做免疫印跡檢測。在 COS7細(xì)胞裂解液上清(圖1B)與 GST-IGFBP4+UL23-FLAG(圖1B)泳道中能檢測出 UL23-FLAG,而在 GST+UL23-FLAG(圖 1B)的泳道中不能檢測出 FLAG-UL23,以上實驗結(jié)果表明,pUL23在體外與 IGFBP4具有物理性相互作用。

2 免疫共沉淀驗證 pUL23與 IGFBP4之間的相互作用

重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-UL23-HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG經(jīng)測序證實構(gòu)建成功。為了驗證pUL23與 IGFBP4在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,進(jìn)行免疫共沉淀驗證實驗。將 pcDNA3.1(-)-UL23 -HA、pcDNA3.1(+)-IGFBP4-FLAG轉(zhuǎn)入 COS-7細(xì)胞,細(xì)胞裂解上清加入 protein G Plus/protein A agarose suspension,冰上孵育,離心沉淀,最后分別用HA、FLAG抗體做免疫印跡檢測。結(jié)果表明,IGFBP4在細(xì)胞內(nèi)能與 pUL23相互作用,見圖 2。

Figure 1.The interaction of IGFBP4 and pUL23 by GST-pulldown assay.A:the purification of the GST fusion proteins.Lane 1:purified GST protein;Lane 2:purified GST-IGFBP4 protein;M:protein marker;B:Western blotting detection ofpUL23-HA in proteins that binds to GST-IGFBP4.圖 1 GST-pull-down驗證 IGFBP4和 pUL23具有物理性相互作用

Figure 2.Co-IP analysis for the interaction between pUL23 and IGFBP4.圖 2 免疫共沉淀驗證 pUL23和 IGFBP4具有相互作用

討 論

UL23屬 HCMVUS22基因家族成員,這個基因家族包含 12個成員,分別是 UL23、UL24、UL28、 UL29、UL36、UL4、TRSI、IRSI、US22、US23、US24、US26。這個基因家族成員的功能各不相同,如pUL36通過抑制 caspase-8誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來促進(jìn)病毒與細(xì)胞的共生作用[18];有的成員具有基因調(diào)控功能,象 HCMV的 pTRSI和 p I RSI與 pUL69協(xié)同作用HCMV主要 IE啟動子,提高轉(zhuǎn)錄效率等。Adir等[16]研究認(rèn)為 pUL23作為一個 tegument蛋白,可能與早期感染有關(guān),不太可能在病毒裝配中扮演一個關(guān)鍵角色。因為在細(xì)胞質(zhì)中,pUL23可能與細(xì)胞蛋白相互作用,作為胞內(nèi)信號途徑參與基因調(diào)節(jié),或者影響翻譯與轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性,換句話說,通過與細(xì)胞蛋白的作用,可能會控制或抑制胞內(nèi)蛋白參與的抗病毒機(jī)制。

我們通過酵母雙雜交技術(shù)從人胚腎 cDNA文庫篩選到到一個與 pUL23相互作用的蛋白 -IGFBP4。IGFBP4是人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 4,是 IGFBPs家族中最小的分子,為細(xì)胞增殖抑制因子。一種可以與胰島素樣生長因子 (IGFs,IGF1/IGF2)結(jié)合的分泌性蛋白,通過 IGFs調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡、黏附和運動[19]。IGFBP-4與 IGFs結(jié)合可以調(diào)節(jié) IGFs與 IGF-I型受體間的相互作用,影響下游的PI3K、MAPK和 PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,改變其促有絲分裂效應(yīng)、凋亡抑制效應(yīng)和促細(xì)胞運動作用,達(dá)到抑制細(xì)胞生長的目的[20,21]。通過 GST-pull-down、免疫共沉淀技術(shù)表明:pUL23蛋白在胞內(nèi)可以與 IGFBP4相結(jié)合。由于 IGFBP4是分泌蛋白,pUL23與 IGFBP4相互作用有可能將其滯留在細(xì)胞質(zhì)中,不讓其分泌到胞外,使 IGFBP4不能與 IGF-I型受體相互作用,也有可能是 pUL23與 IGF1/IGF2競爭結(jié)合IGFBP4,從而影響 IGFBP4發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的功能。因此,我們推測當(dāng) HCMV感染細(xì)胞后,病毒pUL23蛋白與宿主蛋白 IGFBP4的相互作用,可能會影響 IGFBP4調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的過程,從而調(diào)控病毒的生長過程。pUL23蛋白與宿主蛋白 IGFBP4相互作用的研究為進(jìn)一步闡述 pUL23調(diào)控病毒生長分子機(jī)制奠定了堅實基礎(chǔ)。

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