伍模鑫, 肖文娟, 劉澤寰

(暨南大學生命與健康工程研究院分子生物研究中心,廣東廣州 510632)

Toll樣受體 (Toll-like receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類能夠識別許多不同病原體和內(nèi)源分子的天然免疫受體家族,主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞等細胞膜上,在天然免疫應答中起著非常關鍵的作用。作為模式識別分子,它首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn),對胚胎側線發(fā)育起重要作用[1]。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體,主要以單獨或是與其它成員形成異源二聚體的形式來激活信號轉導,促進各種炎癥因子的釋放,從而在早期啟動固有免疫應答,在宿主的天然免疫防御中發(fā)揮重要作用[2,3]。人類Toll樣受體 2(Toll-like receptor 2,TLR2)的編碼基因位于第 4號染色體 (4q32),在天然免疫應答中起著非常重要的作用。TLR2主要以和 TLR1或者TLR6結合成異源二聚體的形式來識別它們的配體, TLR1/TLR2異二聚體能夠識別多種細菌的脂肽,而TLR6/TLR2異二聚體能夠識別支原體脂蛋白和肽聚糖。研究證實,TLR2基因的多態(tài)性能夠影響宿主的固有免疫應答和天然免疫防御[4],但目前還沒有關于中國漢族正常人群 TLR2基因座位的多態(tài)性研究報導,鑒于 TLR2基因在天然免疫中的重要作用,本研究首次以較大樣本的廣東漢族人群為研究對象,獲得 TLR2基因功能性多態(tài)性圖譜及其分布頻率,為揭示漢族人 TLR2基因多態(tài)性特征以及進一步的疾病相關性和遺傳進化研究提供重要的基礎數(shù)據(jù)。

材 料 和 方 法

1 樣本收集和基因組DNA提取

共采集廣東地區(qū) 200例漢族無親緣關系個體的健康外周血樣本,采血對象年齡在 19-48歲間,男女性別比例為 1∶1.2。用 e.Z.N.A.TM血液 DNA抽提試劑盒(Omega)提取基因組DNA。研究獲得暨南大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,所有采血對象均簽署知情同意書。

2 目的片段的擴增和測序

根據(jù) GenBank公布的人類 TLR2基因信息 (Accession:NG_016299;Region:154823891..154847642; Version:NC_016299.1;GI:281332105),用 Oligo 6.0軟件 (MolecularBiology Insight Inc.)設計引物,對隨機抽取的 24例廣東漢族人 TLR2基因的啟動子區(qū)、外顯子區(qū)和部分內(nèi)含子區(qū)進行 PCR擴增,擴增引物見表 1。PCR擴增程序:最初 94℃5 min,35個循環(huán):94℃30 s,退火 30 s(各片段退火溫度見表 1), 72℃90 s;最后 72℃10 min。PCR產(chǎn)物用 3S Spin PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (上海申能博彩公司)純化后,用 AB I PR IS M 377自動測序儀測序 (英偉創(chuàng)津公司),測序引物與擴增引物相同,每個擴增片段均進行正反向 2次測序。對照參考序列,用 Clustal-X 1.81軟件比對測序結果獲得 TLR2基因多態(tài)性位點信息。

3 多態(tài)性位點基因分型

針對上述 24例測序樣本中發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotides polymorphis ms,SNPs)位點,采用 PCR-sequence specific primer(PCR-SSP)方法在剩余的 176例樣本中進行進一步的檢驗,PCR引物和退火溫度見表 1。針對上述 24例測序樣本中發(fā)現(xiàn)的插入 /缺失 (insertion/deletion, INDEL)多態(tài)位點(-196到 -174),則采用常規(guī) PCR方法對剩余 176例樣本進行檢驗,PCR引物為正義鏈:5'-cacggaggcagcgagaaa-3',反義鏈:5'-ctgggccgtgcaaagaag-3'。PCR程序為:首先 95℃5 min;其次35個循環(huán):95℃30 s、60℃40 s、72℃40 s;最后 72℃7 min。PCR產(chǎn)物用3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,出現(xiàn) 284 bp單條帶的是野生型,出現(xiàn) 264 bp單條帶的是缺失純合型,出現(xiàn) 286 bp和 264 bp 2條帶的是插入/缺失雜合型。

4 統(tǒng)計學處理

對照參考序列,用 ClustalX 1.81軟件[5]比對測序結果獲得多態(tài)性位點信息;用 SPSS 13.0軟件進行卡方檢驗;用DnaSP 5.10軟件[6]計算 Tajima's D、Fu &Li'sD值和頻譜分析;用軟件 Haploview 4.1[7]進行連鎖不平衡分析;用Mega 4.1軟件[8]進行同義和非同義核苷酸替代分析(采用Li-Wu-Luo計算方法)。

結 果

通過對 24例廣東漢族人 TLR2基因啟動子區(qū)、外顯子及其周圍內(nèi)含子區(qū)進行測序,共發(fā)現(xiàn) 5個SNPs位點,分別是:-18945C/T、-18883C/G、rs3804099(+597A/G)、rs3804100(+1350A/G)和rs5743705(+2121A/G)。對比美國國立生物信息中心 (National Center for Biotechnology Information,NCB I)dbSNP數(shù)據(jù)庫已有數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),位于啟動子區(qū)的 2個 SNPs-18945C/T和 -18883C/G是首次發(fā)現(xiàn),見圖 1;位于編碼區(qū)的 3個 SNPs rs3804099、rs3804100、rs5743705均屬于同義突變,不引起氨基酸的改變。在 24例廣東漢族人樣本中,沒有發(fā)現(xiàn)在歐洲人群中分布頻率較高的 2個非同義 SNPs位點 rs5743704 (+1893 A/T,His631Pro)和 rs5743708(+2259 A/ G,Gln753Arg)。此外,本研究還在第 1外顯子區(qū) (-196到 -174)發(fā)現(xiàn) 1個長度為 22 bp的 INDEL多態(tài)性位點,見圖 1。6個多態(tài)性位點都符合 Hardy-Weinberg平衡 (P＞0.05)。除 SNPs-18945C/T和-18883C/G外,其余 4個多態(tài)性位點的次要等位基因頻率 (minor allele frequency,MAF)均大于 0.05,見表2。

表1 PCR擴增、測序及基因分型引物Table 1 .Primers used in this study

Figure 1.Two novel SNPs and one INDEL polymorphis m found inTLR2gene.A:promoter(-18945,CT genotype);B:promoter (-18883,CG genotype);C:promoter(DEL/DEL genotype);D:promoter( IN/ IN genotype).The arrows represent mutation sites.圖 1 TLR2基因中新發(fā)現(xiàn)的 2個 SNPs和 1個 INDEL多態(tài)位點

表2 廣東漢族人群 TLR2基因功能多態(tài)性位點的相關信息Table 2 .Characterization of functional genetic polymorphis ms in TLR2locus in Chinese Cantonese population

在剩余 176例樣本中對 SNPs-18945C/T、-18883C/G、rs3804099、rs3804100、rs5743705以及 INDEL多態(tài)性進行基因分型,并與高加索人群、非洲裔美洲人群、日本人群、印度人群和中國臺灣人群進行了比較,見表 3。比較發(fā)現(xiàn),廣東漢族人和高加索人在 SNPs rs3804100、rs3804099和 INDEL多態(tài)性頻率分布上差異顯著 (P＜0.05);與非洲裔美洲人相比,在 SNPs rs3804099和 rs3804100頻率分布上差異顯著,而在 INDEL多態(tài)性頻率分布上無明顯差異;廣東漢族人和印度人在 SNP rs3804100和 INDEL 2個位點的頻率分布上則有顯著差異 (P＜0.05);SNPs-18945C/T、-18883C/G、rs5743705在其它人群中的頻率至今尚未有報道。

表3 廣東漢族人群 TLR2基因功能多態(tài)性位點的等位基因頻率及與其他人群的比較Table 3 . Functional genetic polymorphisms and theirminor allele frequencies ofTLR2in different populations

本研究計算了 TLR2基因全部功能區(qū)片段和單獨編碼區(qū)片段的核苷酸多樣性 (nucleotide diversity, π),分別為 0.27×10-3和 0.34×10-3,低于人類基因組的平均水平 (0.8×10-3和 0.5×10-3)[9,10]。TLR2基因調(diào)控區(qū)的 Tajima'D值和 Fu&Li's D值分別為 -1.46879和 -2.51415,編碼區(qū)的 Tajima'D值和 Fu&Li'sD值分別為0.52381和0.89595,但都不顯著(P＞0.05),沒有背離中性進化。進一步的頻譜分析也發(fā)現(xiàn),TLR2基因 SNP頻譜分布規(guī)律符合中性進化,見圖 2。此外,我們還根據(jù)Li-Wu-Luo的方法計算得到 TLR2編碼區(qū)的非同義 (dN)和同義 (dS)核苷酸替代比值 (dN/dS)為 0∶0.0010。用 Haploview 4.1對 TLR2基因 6個多態(tài)性位點進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),SNPs-18945C/T和 -18883C/G完全連鎖(D'=1,r2=1),SNPs rs3804099和 rs3804100之間緊密連鎖(D'=1,r2=0.89),見圖 3。

Figure 2.The frequency spectrum analysis chart in the function region ofTLR2gene.The curve represents expected values.Histogram represents the actual observed values.圖 2 TLR2基因功能區(qū)的頻譜分析

討 論

Figure 3.Linkage disequilibrium(LD)plots of the six functional polymorphis ms inTLR2. r2(×100)values were depicted in the diamonds.Stand Color Scheme:r2= 0,white;0＜r2＜1,shades of grey;r2=1,black.圖 3 廣東漢族人群 TLR2基因功能多態(tài)性位點的連鎖不平衡分析

本研究新發(fā)現(xiàn)的 SNP-18945C/T靠近轉錄起始位點,-18883C/G則位于靠近轉錄因子 Ets-1的結合區(qū)的 CpG區(qū)域[11],二者均有可能引起 TLR2基因的轉錄水平發(fā)生變化。已有報道指出,啟動子區(qū)域的CpG甲基化會影響上皮細胞TLR2基因的轉錄水平[12]。同樣,本研究觀察到的 TLR2基因第 1外顯子區(qū)的 1個 22bp的 INDEL突變 (-196到 -174),也曾被人利用體外構建熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,其缺失純和型 (DEL/DEL)與野生型 ( IN/ IN)相比具有更低的熒光素酶活性,說明該缺失會降低 TLR2基因的轉錄表達水平[13]。此外還有報道認為該突變會增加印度北部婦女患子宮頸癌的風險[14],也會增加日本人患潰瘍性結腸炎胃癌和十二指腸癌的風險[15,16]。

人類先天免疫相關基因的多態(tài)性水平通常較低[17]。本研究中也發(fā)現(xiàn),廣東漢族人群 TLR2基因功能區(qū)的核苷酸多樣性低于人類基因組平均水平。另外,dN/dS為 0∶0.001,也遠遠小于理論值 3∶1。這些結果均表明,廣東漢族人群 TLR2基因在進化過程中可能受到一定的定向選擇壓力。然而,這與 Tajima、Fu and Li's檢驗以及頻譜分析結果有一定的出入,這些檢驗則顯示 TLR2基因多態(tài)性沒有背離中性進化理論。因此,廣東漢族人群 TLR2基因功能區(qū)多態(tài)性水平較低以及編碼區(qū) dN/dS比值偏低也有可能是遺傳漂變(genetic drift)的結果。

人類基因多態(tài)性在不同種群、地區(qū)間的分布具有明顯的差異。在本研究中,廣東漢族人與高加索人、非洲裔美洲人在 TLR2基因多態(tài)性頻率分布上差異明顯。在歐洲人群中頻率較高的 2個非同義 SNPs位點rs5743704(His631Pro)和 rs5743708(Gln753Arg)在廣東漢族人群中則沒有被發(fā)現(xiàn),據(jù)報道它們與急性反應性關節(jié)炎的易感性相關[18]。亞洲人群中,廣東漢族人與日本人在 TLR2基因多態(tài)性頻率分布上無明顯差異,但卻與印度人差異明顯。產(chǎn)生這種差異的原因可能與不同種群長期受到不同的自然選擇壓力以及與遺傳漂變、遷徙(migration)等因素有關。

在本研究發(fā)現(xiàn)的 6個多態(tài)性位點中,根據(jù)連鎖不平衡分析結果,-18945C/T和 -18883C/G之間以及 rs3804099和 rs3804100之間的 r2均≥0.8,并且后兩者和 rs5743705均為同義突變,沒有太大的研究價值,因此建議在今后的疾病相關性研究中,選擇更靠近轉錄調(diào)控位點的 -18883C/G作為標簽 SNP (tSNP),結合位于基因的 5'非翻譯區(qū)的 INDEL作為研究靶點。

由于 TLR2基因在天然免疫中的重要作用,其基因多態(tài)性與疾病的易感關系已成為眾多疾病致病機制研究的一大熱點。但是,直接選擇其他國家、民族人群中已發(fā)現(xiàn)的高風險位點在中華民族人群中進行研究,極有可能導致一些偏差,因此建立一個大樣本的中華民族正常人群 TLR2基因多態(tài)性圖譜是極有必要的,這一策略同樣也適用于中華民族其它基因的多態(tài)性研究。本研究首次系統(tǒng)、全面地建立了廣東漢族人群 TLR2基因座位功能區(qū)的多態(tài)性圖譜,為在漢族人群中開展病例對照研究提供了一些有據(jù)可依的 tSNPs位點作為檢測靶點,它將為今后的 TLR2蛋白功能、疾病易感性、致病機制乃至人群進化研究提供重要的資料。

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