江 濤,譚春萍,任靈芝,黃百花,劉文娟,陸芹章*

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧530005;2.固始縣動物疫病預防控制中心,河南固始465200)

產毒素多殺性巴氏桿菌(Toxingenic Pasteurella multocida,T+Pm)是豬進行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原之一[1-2]。該菌與支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)感染豬后損害其呼吸道,使機體抵抗力下降,并可繼發(fā)感染支原體、嗜血桿菌、豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒,增加了豬的病死率[3]。多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)為PAR的主要致病因子[4-6],由T+Pm toxA基因編碼的大小為146 ku的蛋白,是重要保護性抗原之一[7],也是鑒別T+Pm與非產毒素巴氏桿菌(Non-toxingenic Pasteurella multocida,T—PM)的主要對象,因而研究PMT對該病的臨床診斷及防控有重要意義。

目前對于PAR的防控主要是使用抗生素類藥物,但抗生素的使用導致耐藥菌株的產生及其殘留,嚴重威脅到公眾的健康,因此研制PAR疫苗倍受關注[8-9]。天然毒素作為PAR的重要保護性抗原,但其分泌量低,不到菌體蛋白的0.6%,且蛋白的純化復雜,純類毒素與粗類毒素對機體的免疫效果存在差異。因此,本研究通過對該毒素基因的克隆表達及其免疫學特性的研究,可為臨床疫苗研制提供足量的高純度抗原及該毒素檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒、試劑及培養(yǎng)基 豬源D型產毒素多殺性巴氏桿菌由廣西大學動物科學技術學院預防獸醫(yī)實驗室分離鑒定;大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)、PET-32a(+)表達載體購自Novagen公司;PMD-18T克隆載體、酶、dNTPs、IPTG、Bam HⅠ及SalⅠ為寶生物工程(大連)有限公司產品;辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG、氨芐青霉素為Sigma公司產品;膠回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產品;Ni-NTA蛋白純化樹脂購自QIAGEN公司產品;LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基和LA培養(yǎng)基(LB+15 g/L瓊脂),篩選培養(yǎng)基為含100 μ g/mL氨芐的LA培養(yǎng)基,均由本室自制。1.1.2 實驗動物 16 g～20 g昆明小鼠,購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 根據GenBank上公布的toxA序列AF240778及參考文獻[1]設計一對引物:toxA-F:5′-TAGGATCCATGAAAACAAAACATT TT T T-3′;toxA-R:5′-GCGTCGACT TATAGTGCTCT TGT TAAGC-3′

分別在toxA-F及toxA-R的5′端加入BamHⅠ及SalⅠ酶切位點如劃線部分所示,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 toxA基因的克隆和表達載體的構建 將分離鑒定的產毒素多殺性巴氏桿菌[10]擴大培養(yǎng)后,按文獻[11]中的方法將菌體洗滌反復凍融后作為toxA基因擴增模板。采用25 μ L的PCR反應體系:10×Taq buffer 2.5 μ L,20 mmol/L MgCl2 2.5 μ L,2 μ mol/L dNTPs 0.5 μ L,20 μ mol/L上下游引物各0.5 μ L,Taq DNA polymerase 0.5 μ L,無菌水15 μ L,模板3 μ L。PCR擴增反應條件為:94℃變性5 min;94℃,30 s,50℃,30 s,72℃3.5 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收PCR產物,與pMD-18T連接后轉化大腸埃希菌DH5α,獲得重組質粒PMD-toxA。經測序和用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定后,回收3 858 bp的toxA片段。將回收的toxA片段和經相同酶酶切后的pET-32a用T4 DNA連接酶連接,轉化大腸埃希菌DH5α。將篩選陽性克隆擴大培養(yǎng)后,提取重組質粒PET-toxA,用BamHⅠ和SalⅠ酶切鑒定。

1.2.3 toxA基因原核表達載體的誘導表達和表達產物的提取 將重組表達質粒PET-toxA轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑取單個菌落,于37℃培養(yǎng)至OD630值達到0.6～0.8,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6 h,收集菌體。按常規(guī)方法提取包涵體,進行80 g/L分離膠的SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組蛋白的純化及Westen blot檢測 按《分子克隆實驗指南(第3版)》所述方法對表達產物toxA進行Western blot分析。用豬萎縮性鼻炎疫苗(含毒素)免疫的豬陽性血清作為一抗,二抗為HRP標記的羊抗豬IgG。

1.2.5 表達產物的小鼠攻毒試驗 利用Ni-NTA樹脂對1.2.3中處理包涵體蛋白進行純化,并將純化后的重組蛋白復性,無菌PBS透析,濾膜過濾后備用。將30只昆明鼠分為6組,5只/組,其中Ⅰ～Ⅳ組按參考文獻[12]的攻毒劑量,用表達產物進行腹腔注射攻毒,0.2 mL/只,Ⅴ組用抽提的天然毒素[10]進行攻毒,Ⅵ注射無菌PBS作為陰性對照。觀察小鼠在72 h內的臨床表現(xiàn)及其剖檢變化。

1.2.6 表達產物免疫原性檢測 將上述攻毒后存活且精神狀態(tài)恢復小鼠分別在攻毒后的第15天、28天以相同劑量的表達蛋白進行腹腔注射免疫接種,在第40天采血,分離血清于—20℃保存?zhèn)溆?。將表達產物及天然毒素蛋白以1 μ g/點點樣于硝酸纖維素膜上,置37℃吸附30 min后,于4℃封閉過夜,用PBST洗3遍后加入1∶200稀釋的上述小鼠陽性血清及空白血清,并按Westen blot步驟進行操作,觀察表達產物免疫后血清反應原性。

1.2.7 表達產物對免疫血清的檢測 按照參考文獻[13]方法稍加改進提純天然毒素,利用方陣滴定的方法確定天然毒素與表達重組蛋白的最佳包被濃度與陽性血清的最佳稀釋度,兩種抗原按最佳濃度包被后,按間接ELISA的常規(guī)操作方法,對10份陽性血清(瓊擴效價達到1∶16～1∶32)及陰性血清進行檢測。每份血清重復3次,求其OD450平均值作為試驗結果,對比天然毒素與重組蛋白的差別。

2 結果

2.1 toxA基因的克隆和表達載體的構建

PCR擴增toxA片段約為3 858 bp與預期結果相符(圖1)。將目的片段插入到pET-32a的BamHⅠ和SalⅠ位點,得到重組表達質粒PET-toxA,其雙酶切鑒定結果如圖2所示,片段大小分別為3 858 bp和5 900 bp。

2.2 toxA基因的表達

將構建的質粒PET-toxA轉化到E.coli BL21(DE3),經IPTG誘導和SDS-PAGE分析,在175 ku處有明顯的表達條帶。表達產物SDS-PAGE電泳后轉膜進行Westen blot,結果表明,在175 ku左右出現(xiàn)特異性反應條帶,對照菌未出現(xiàn)明顯條帶(圖3)。

2.3 動物試驗

試驗小鼠攻毒后,Ⅰ組～Ⅳ組(攻毒用劑量分別為0.75、1.5、3、10 μ g)72 h內未出現(xiàn)死亡,但攻毒小鼠均表現(xiàn)為精神沉郁,活動量減少,第Ⅳ組表現(xiàn)最為嚴重,第Ⅰ組相對較輕;Ⅴ組在攻毒后的72 h內全部死亡;Ⅵ組無任何臨床表現(xiàn),第Ⅴ組剖檢見內臟有小點出血,肝、脾表面有半透明的假膜。剖檢存活小鼠發(fā)現(xiàn):第Ⅵ組無可見病變;第Ⅰ組～Ⅳ組,肝、腎、心外膜及內膜均有出血點,脾臟較第Ⅵ組小,但無假膜出現(xiàn)。

2.4 表達產物的免疫原性

待攻毒小鼠恢愎正常精神狀態(tài)后,對第Ⅳ組小鼠兩次用10 μ g表達產物進行腹腔注射,取血清進行Dot-ELISA鑒定,結果表明該陽性血清均與天然毒素蛋白及表達重組蛋白反應,對照血清無可見反應(圖4)。

圖1 PCR擴增毒素基因Fig.1 Amplified the gene of Pasteurella multicoda toxA by PCR

圖2 重組質粒(PET-toxA)的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant PET-toxA plasmid by digestion

圖3 重組質粒PET-toxA的表達產物的Westen blot(A)及SDS-PAGE(B)結果Fig.3 Westenen blot(A)and SDS-PAGE(B)results of PET-toxA ex pression products

圖4 重組蛋白的免疫原性鑒定Fig.4 The identification of antigenicity of recombinant protein

2.5 表達產物對免疫血清的檢測

根據棋盤滴定的結果,天然毒素與表達蛋白的最佳包被濃度為1.25 μ g/mL和0.6 μ g/mL,血清的最佳稀釋度為1∶200。在血清檢測結果(表1)中,天然毒素抗原檢測OD450值顯著高于重組蛋白,P/N值二者無明顯差異;陰性血清檢測OD450值也高于表達蛋白,說明表達蛋白非特異性較高。

表1 表達產物對免疫血清的檢測結果Table 1 The results of detect to antiserum against native PMD using expression products

3 討論

PMT是PAR的重要的保護性抗原,以PMT制作的疫苗能夠產生特異性的保護。因此PMT疫苗的研究對實際生產有著重要的意義。但由于菌體免疫效果不理想,天然毒素在菌體的含量較低,大量提純的難度及費用較高,因此用天然PMT生產疫苗是不現(xiàn)實的。為解決上述難題,人們通過對PMT亞單位疫苗及核酸疫苗的研究取得了一定的成果,因此,這兩種疫苗的研究在AR的防控中是極具前景的疫苗。

本研究成功地擴增出豬源D型產毒素多殺性巴氏桿毒素toxA基因,并對其進行表達。攻毒試驗結果表明,表達重組蛋白具有一定的生物學活性,能夠引起小鼠的病變,但無天然蛋白活性強。可能是表達蛋白的構象并未達到天然蛋白那樣完美使其毒性存在差別,或者是表達蛋白本身所帶載體部分的蛋白抑制其生物學特性,這還需要進一步的探討驗證。Western blot分析及重組蛋白免疫小鼠動物試驗表明,重組蛋白具有免疫原性及反應原性,為臨床應用疫苗的研制及利用抗原抗體結合方法檢測毒素奠定了基礎。Asuka T I等[14]利用DEAE親和層析方法純化重組蛋白,檢測疫苗免疫血清已取得了較好的檢測效果。本研究的檢測結果表明,重組蛋白的OD450值較低,可能是因為表達蛋白與天然蛋白的空間構象差異所致,但其作為檢測用抗原非特異性反應弱。表達蛋白能否用于臨床檢測血清中的抗體,仍需對其表達的條件進行進一步的試驗研究。

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