黃紅梅，屈金亭，劉 濤

內(nèi)源性一氧化氮（NO)是由左旋精氨酸（L-A rg)在一氧化氮合成酶（NOS)的作用下產(chǎn)生的，是一種化學(xué)性質(zhì)活躍的氣體自由基，亦是一種重要的生物信號(hào)分子。在心血管系統(tǒng)中，NO具有擴(kuò)張血管，抑制血小板黏附和聚集，抑制血管平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖，以及影響心臟舒縮周期和收縮力等功效[4]。大量研究表明，心血管系統(tǒng)NOSNO系統(tǒng)功能與機(jī)體運(yùn)動(dòng)形式、強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[19]。NOS是調(diào)節(jié)NO合成的關(guān)鍵酶，已確認(rèn)有3種同工酶：神經(jīng)元型（nNOS)、內(nèi)皮型（eNOS)和誘導(dǎo)型（iNOS)，它們分布的部位、生物效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制各不相同。研究表明，心血管系統(tǒng)NO主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS)催化合成[17]。最近，Kleinbongard等發(fā)現(xiàn)，eNOS亦存在于紅細(xì)胞漿膜，表明紅細(xì)胞也是心血管系統(tǒng)內(nèi)NO的主要來源之一[7]。本研究擬觀察不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)男子賽艇運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量/活性和磷酸化水平，以及血漿中 NO含量的變化，以探討紅細(xì)胞eNOS-NO系統(tǒng)對(duì)于運(yùn)動(dòng)刺激的應(yīng)答及可能機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

專業(yè)賽艇運(yùn)動(dòng)員10名（一級(jí)和健將級(jí))，年齡21.6± 1.9歲，身高1.89±0.05 m，體重80.5±7.9 kg，訓(xùn)練年限5.8±1.9年。所有參加實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)員均身體健康，無器質(zhì)性疾病，實(shí)驗(yàn)前48 h內(nèi)受試者均未進(jìn)行過劇烈運(yùn)動(dòng)。

1.2 測試方案

受試者于清晨（6：30～7：30)靜臥15 min，空腹，肘靜脈采血5mL。然后進(jìn)行劃船測功儀（CONCEPTⅡ，美國)遞增負(fù)荷測試來測定受試者的 ˙VO2max，測試前以16槳/ min負(fù)荷做5min準(zhǔn)備活動(dòng)，準(zhǔn)備活動(dòng)后休息5min并佩戴好呼吸面罩，起始負(fù)荷為20槳/min，每3 min增加2槳，直至力竭。用運(yùn)動(dòng)心肺測試系統(tǒng)（Cortex MetaLyzerⅡ，德國)測定耗氧量（˙VO2)、CO2呼出量（VCO2)、呼吸交換律（RER =VCO 2/˙VO2)、每分通氣量（VE)等，用遙測心率表（Polar A 3，芬蘭)記錄心率。受試者休息1周后，進(jìn)行1次60％ ˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)（劃船測功儀)，時(shí)間為20min，運(yùn)動(dòng)結(jié)束后即刻肘靜脈采血5 mL；休息2天后，進(jìn)行1次75％ ˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)，再休息2天，進(jìn)行1次90％˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)，其運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及取血量與第1次相同。

1.3 紅細(xì)胞的制備

所有血液樣品均加入38 g/L枸櫞酸鈉（體積比1∶9)抗凝，1 400 g離心10 min，去上清。加入4倍體積 Hank’s平衡鹽溶液（M HBSS)中反復(fù)離心3遍，清洗后取紅細(xì)胞懸浮于等體積 Hank’s平衡鹽溶液中待測。

1.4 紅細(xì)胞eNOS活性及血漿NO-2/NO-3含量測定

依照試劑盒（南京建成生物公司)說明，紫外分光光度計(jì)測量紅細(xì)胞 eNOS活性，自動(dòng)生化分析儀測定血漿NO-2/NO-3含量。

1.5 紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平測定

制備紅細(xì)胞組織勻漿，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。蛋白樣品經(jīng)15％SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗（Santacruz公司)孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗（TBD公司)孵育1 h，ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件（上海天能科技公司)，掃描各條帶灰度值，以安靜狀態(tài)為100％，其他3組與安靜時(shí)比值，即其相對(duì)表達(dá)量（％)。Actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較采用單因素方差分析，P ＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著水平。

2 研究結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)血漿NO-2/NO-3含量的影響

圖1顯示，與安靜狀態(tài)比較，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60％和75％ ˙VO2max時(shí)，血漿 NO-2/NO-3含量顯著升高（均為 P＜ 0.05)，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90％˙VO2max時(shí)，血漿NO-2/NO-3含量顯著降低（P＜0.05)。

2.2 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)紅細(xì)胞eNOS活性的影響

圖2顯示，與安靜狀態(tài)比較，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60％和75％ ˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS活性顯著升高（分別為 P＜0.05和 P＜0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90％˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS活性顯著降低（P＜0.01)。

圖1 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)血漿NO2-/NO3-含量的影響示意圖

圖2 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS活性的影響示意圖

2.3 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平

圖3顯示，與安靜狀態(tài)比較，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60％和75％ ˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS蛋白總量和 Thr495磷酸化eNOS蛋白量無明顯變化，Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著升高（分別為 P＜0.05和 P＜0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90％ ˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS蛋白總量和Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著降低（均為 P＜0.05)，Thr495磷酸化eNOS蛋白量無明顯變化。

圖3 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平的影響示意圖

3 討論

NO作為重要的信號(hào)分子，與運(yùn)動(dòng)關(guān)系十分密切。研究表明，運(yùn)動(dòng)過程中，血液中一定水平的NO可通過環(huán)鳥苷酸通路提高心肌和骨骼肌收縮力；可增加運(yùn)動(dòng)中組織氧攝入量和氧消耗量；可通過舒張血管調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)中機(jī)體各器官血液重新分布；也可通過刺激 GLU-4轉(zhuǎn)位促進(jìn)組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等[10]。此外，NO還可通過調(diào)控紅細(xì)胞變形性影響運(yùn)動(dòng)中紅細(xì)胞的功能[8]。Sun等報(bào)道，大鼠運(yùn)動(dòng)前服用一定劑量L-A rg，可改善機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，明顯延長遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的力竭時(shí)間，推遲疲勞發(fā)生[14]。而注射了NOS抑制劑N-硝基左旋精氨酸（L-NAM E)的人骨骼肌最大收縮速度及輸出功率明顯降低[6]。這表明，運(yùn)動(dòng)中維持一定水平的NO可正性調(diào)控機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。目前的研究主要關(guān)注于運(yùn)動(dòng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞以及骨骼肌產(chǎn)生NO的影響，最近發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞亦是心血管系統(tǒng)中NO的主要來源，這與定位于紅細(xì)胞漿膜的eNOS密切相關(guān)[7]。研究表明，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性及脂質(zhì)組成的作用效應(yīng)不同[16]。因而，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS功能及NO產(chǎn)生也會(huì)產(chǎn)生差異性作用，從而影響心血管系統(tǒng)中NO的穩(wěn)態(tài)及生物效應(yīng)。

本研究中，在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60％和75％˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS活性顯著升高，且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而增加，而eNOS總蛋白表達(dá)量無明顯變化。當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加為90％˙VO2max時(shí)，紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量及活性均明顯降低，甚至低于運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)時(shí)的水平。血漿NO含量的變化趨勢(shì)與紅細(xì)胞eNOS基本一致，提示運(yùn)動(dòng)過程中，紅細(xì)胞產(chǎn)生的NO是血漿NO總量的重要組成部分。Rassaf等發(fā)現(xiàn)，前臂分別進(jìn)行20％、30％和40％的最大握力強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，前臂靜脈血漿中NO和血流量與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度呈正向的線性關(guān)系；而當(dāng)強(qiáng)度增加至50％和60％時(shí)，上述指標(biāo)與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系[12]。Copp等報(bào)道，短期急性跑臺(tái)訓(xùn)練可使大鼠后肢血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及血漿NO含量急劇增加，而力竭運(yùn)動(dòng)使上述指標(biāo)顯著降低，運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h仍然低于安靜對(duì)照組[2]。我們認(rèn)為，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可刺激紅細(xì)胞等組織中eNOS表達(dá)量及活性升高，舒張血管，增加血流量，以代償運(yùn)動(dòng)造成的組織血液供應(yīng)相對(duì)不足；而當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)一步增加時(shí)，eNOS-NO生物效應(yīng)反而受到抑制，這可能與運(yùn)動(dòng)疲勞的形成相關(guān)。

運(yùn)動(dòng)可使血流加速，產(chǎn)生搏動(dòng)性血流并增加血管內(nèi)血流切應(yīng)力，且血流切應(yīng)力隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而增加。研究證實(shí)，血流切應(yīng)力是運(yùn)動(dòng)促血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的主要生理刺激。Fischer等在體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，高血流切應(yīng)力亦可顯著激活紅細(xì)胞中eNOS[3]。最近，Suhr等的研究表明，短暫的高血流切應(yīng)力可增加紅細(xì)胞eNOS的活性，而高頻反復(fù)的高血流切應(yīng)力反而會(huì)抑制 eNOS的活化[13]。Temiz等發(fā)現(xiàn)，在低水平血流切應(yīng)力下，紅細(xì)胞膜呈彈性固態(tài)，而在高水平切應(yīng)力下，紅細(xì)胞膜呈液態(tài)[15]。因而，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能通過影響改變血流切應(yīng)力影響紅細(xì)胞膜狀態(tài)，從而動(dòng)態(tài)調(diào)控位于紅細(xì)胞漿膜eNOS的穩(wěn)定性及活性。此外，Petibois等發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可加速紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的脫失與降解[11]，這可能與90％˙VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成的eNOS表達(dá)量快速減少有關(guān)。

除了蛋白表達(dá)量的變化，特定氨基酸的磷酸化也決定了eNOS的活性。eNOS主要有 3個(gè)磷酸化位點(diǎn)：Ser116、Thr495和 Ser1177，其中，Ser1177磷酸化使eNOS活性增強(qiáng)，而Ser116和 Thr495磷酸化則使eNOS活性減弱。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，60％和 75％˙VO2max的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可使 eNOS （Ser1177)磷酸化水平增加，且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加。而在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90％˙VO2max時(shí)，eNOS（Ser1177)磷酸化水平降低，eNOS（Thr495)磷酸化水平在各種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度中均維持于運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)水平。研究表明，血管中的血流切應(yīng)力可以激活紅細(xì)胞中磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt)信號(hào)通路，從而上調(diào)紅細(xì)胞eNOS Ser1177磷酸化水平和NO產(chǎn)量[5]。因而我們推測，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能通過PI3 K-Akt通路上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，從而增加其活性和NO產(chǎn)量。而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的eNOS Ser1177磷酸化水平降低可能與紅細(xì)胞eNOS蛋白總量減少有關(guān)，或有其他的抑制機(jī)制發(fā)生，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1.當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度適量時(shí)，紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加，可能是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的一種適應(yīng)機(jī)制。

2.當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過大時(shí)，紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生受到抑制，可能與運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生相關(guān)。

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