宋宏新， 胡圍圍， 薛海燕， 田 穎

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

雞卵黃免疫球蛋白(Immunoglobulin of egg yolk，簡(jiǎn)稱IgY)，又稱雞卵黃抗體，是母雞血液中的免疫球蛋白傳遞至雞卵黃并在子雞孵育過(guò)程中和孵育后對(duì)子雞起保護(hù)作用的免疫球蛋白.IgY具有成本低、安全、易大規(guī)模制備、不與人類補(bǔ)體結(jié)合以及不與類風(fēng)濕因子結(jié)合等免疫學(xué)特性，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)診斷、醫(yī)療和食品檢測(cè)等諸多方面[1-5].因此，特異性卵黃抗體的制備也引起了人們足夠的重視，對(duì)IgY分離純化的研究有著重要意義.本研究以大腸桿菌為免疫原，通過(guò)強(qiáng)化免疫技術(shù)，從免疫雞卵黃中提取抗大腸桿菌抗體，研究了卵黃抗體的分離純化工藝，為IgY的免疫分析和臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

大腸桿菌(本實(shí)驗(yàn)室保存).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用120日齡產(chǎn)蛋雞，隔離飼養(yǎng)一周，4只進(jìn)行免疫，1只作為陰性對(duì)照.

1.1.3 試劑儀器

完全弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑(美國(guó)sigma 公司)；標(biāo)準(zhǔn)雞IgG及HRP酶標(biāo)兔抗雞IgG(北京新經(jīng)科生物制品有限公司)；牛血清白蛋白(上海化學(xué)試劑公司)；過(guò)硫酸銨(天津市化學(xué)試劑六廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀MK3 (WELLSCAN 芬蘭)；混合纖維素酯微孔濾膜(上海興亞凈化材料廠)；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(科大中佳)；親和色譜柱(HiTrapTM IgY Purification HP柱體積5 mL)(美國(guó)通用電氣公司).

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

將大腸桿菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，離心收集菌體，用生理鹽水將菌體稀釋得1.19×109CFU/mL菌懸液.100 ℃水浴滅活15 min，4 ℃保存.

1.2.2 雞體免疫

將等量的菌懸液與佐劑混勻，充分乳化制成免疫原.每只雞每次兩翼雙翅與胸部肌肉四點(diǎn)注射配制好的免疫原1 mL.首免利用完全弗氏佐劑乳化菌體，誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，加強(qiáng)免疫使用不完全弗氏佐劑，每隔10～15 d加強(qiáng)免疫一次，最后一次不加佐劑免疫，共加強(qiáng)免疫3次，免疫過(guò)程收集卵黃進(jìn)行效價(jià)檢測(cè).

1.2.3 IgY的提取與純化

1.2.3.1 水溶性蛋白的提取

免疫后雞蛋→棄蛋殼、蛋清→用7號(hào)針頭刺破卵黃膜，讓卵黃自動(dòng)流入量筒，收集卵黃液18 mL→用蒸餾水按1∶8稀釋卵黃液，混勻后，用0.1 M鹽酸調(diào)pH 至5.2～5.3，攪拌10 min后于4 ℃過(guò)夜→采用0.45 μm的混合纖維素酯膜進(jìn)行微濾(3%硅藻土助濾)，最后得水溶性組分(Water Solution Fration，簡(jiǎn)稱WSF)100 mL.

1.2.3.2 兩步鹽析

取WSF 30 mL，往其滴加飽和硫酸銨使其終濃度為50%，4 ℃靜置過(guò)夜，離心(10 000 r/min 15 min)，用等體積的0.01 M pH 7.4 PBS溶解沉淀，再加入14%(W/V)硫酸鈉混勻，4 ℃靜置過(guò)夜，離心(10 000 r/min 15 min)，收集沉淀并溶于3 mL 0.01 M pH 7.4 PBS.

1.2.3.3 親和層析純化IgY

樣品預(yù)處理：鹽析后的樣品裝入透析袋，平衡緩沖液A(20 mmol/L PBS，pH 7.4，含0.5 mol/L K2SO4)透析過(guò)夜，0.22 μm微濾膜過(guò)濾.

親和層析過(guò)程：用5倍柱體積的平衡液A平衡親和柱，流速為3.8 mL/min，壓力為0.3 MPa，紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)為280 nm下進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到基線后取預(yù)處理樣品1 mL上樣，先用平衡液A沖洗柱子，IgY由于親和作用結(jié)合在柱子上，而未結(jié)合的物質(zhì)將隨著A液流出，直到?jīng)]有物質(zhì)流出后，改用洗脫液B(20 mmol/L PBS，pH 7.4)沖洗柱子，出峰時(shí)用部分收集器進(jìn)行收集.

1.2.4 抗體含量、純度及活性測(cè)定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[6]，通過(guò)考馬斯亮蘭G-250法測(cè)定制備的抗體的蛋白含量，而抗體純度則利用SDS-PAGE方法，以標(biāo)準(zhǔn)雞IgG作對(duì)照，通過(guò)電泳凝膠分析軟件計(jì)算獲得，電泳分離膠濃度與濃縮膠濃度分別為7.5%和3 %，電泳電場(chǎng)電壓為120 V，電泳蛋白條帶通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R-250染色.最后，將各純化步驟中得到的樣品稀釋至蛋白含量為0.5 μg/mL，采用間接ELISA法[7]測(cè)定制備的IgY與特異抗原的結(jié)合情況，以得到其在純化過(guò)程中活性大小變化結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫效果

免疫后收集雞蛋，提取并獲得WSF后用間接ELISA法監(jiān)測(cè)雞蛋卵黃中IgY的效價(jià)情況，所得免疫應(yīng)答曲線如圖1所示.本研究中的抗原濃度為1.19×109CFU/mL，能激起有效的免疫應(yīng)答，過(guò)低或過(guò)高可能導(dǎo)致免疫不明顯或免疫耐受[7].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二免后開(kāi)始出現(xiàn)特異性抗體，此后抗體效價(jià)隨免疫時(shí)間逐漸上升，高效價(jià)出現(xiàn)在四免后，最高效價(jià)可達(dá)1.6×105，此后效價(jià)幅度有所下降，但能保持在高效價(jià)水平上(>104)并維持2個(gè)月時(shí)間.

圖1 lgY效價(jià)隨時(shí)間的變化曲線 圖2 IgY親和色譜圖

2.2 親和色譜圖

圖3 SDS-PAGE圖譜

圖2為鹽析后樣品在免疫親和色譜柱上的分離情況.從圖中可以看出,上樣后, 未被柱材料吸附的雜蛋白表現(xiàn)為色譜圖的第一個(gè)色譜峰P1，出峰時(shí)間為78 s，峰高131.202 mAU.平衡緩沖液平衡至基線時(shí), 改用洗脫緩沖液, 使抗體與親和色譜柱的結(jié)合能力改變，從而將吸附在柱上的目的蛋白洗脫下來(lái), 表現(xiàn)為圖中的P2峰，出峰時(shí)間為10 min，峰高295.78 mAU，由圖可知，其分離效果較好，能夠使目的蛋白與雜蛋白得到很好的分離.

2.3 電泳結(jié)果

圖4 分離純化組分的效價(jià)

各純化組分經(jīng)電泳分析如圖3所示.卵黃經(jīng)水稀法初步分離，得到的WSF含有較多雜蛋白，WSF主要存在的蛋白包括IgY(γ活性蛋白、α活性蛋白、β活性蛋白和低密度脂蛋白).可以看到經(jīng)50%飽和度(NH4)2SO4一步鹽析后，雜蛋白有所減少，而經(jīng)兩步鹽析后，基本可以除去大部分非γ活性蛋白部分，而經(jīng)親和層析得到的峰P2收集液為單點(diǎn)純.

2.4 活性測(cè)定

通過(guò)間接ELISA方法，對(duì)純化過(guò)程各步驟得到的階段產(chǎn)物的活性進(jìn)行了測(cè)定，相同蛋白濃度(0.5 μg/mL)不同階段的IgY組分經(jīng)間接ELISA過(guò)程測(cè)得的OD450值如圖4所示，隨著分離純化的進(jìn)行，其OD450值略有下降，這一現(xiàn)象表明在純化過(guò)程中抗體的活性有一定程度的下降，但仍然具有很高的活性，該制備過(guò)程適合得到高活性抗體.

2.5 蛋白質(zhì)含量，回收率及純度測(cè)定

表1 各分離步驟所得蛋白質(zhì)的含量及收率

注：蛋白質(zhì)回收率 = 每步提純后蛋白質(zhì)總量/ 微濾液蛋白質(zhì)含量.

測(cè)定水稀釋提取樣品，鹽析后樣品及層析后樣品的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算得到蛋白質(zhì)回收率，由電泳凝膠分析軟件計(jì)算純化后各樣品的純度，其結(jié)果如表1所示，水稀釋提取的蛋白質(zhì)回收率為100%，IgY純度為15.38%，經(jīng)過(guò)鹽析后，卵黃中的大部分雜蛋白已除去，測(cè)得蛋白質(zhì)回收率為49.5%，純度高達(dá)89.9%.親和層析后，蛋白損失的較多，只能得到1.05 mg/mL，但I(xiàn)gY純度高達(dá)96.87%.

盡管親和層析得到的抗體純度高，但儀器昂貴，制備量少，只適合實(shí)驗(yàn)室研究與分析，而經(jīng)過(guò)兩步鹽析得到的IgY的純度也達(dá)到了很高的水平，更適用于抗體的大規(guī)模制備.

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)表明，滅活的大腸桿菌菌體抗原成功的免疫了母雞，制備了抗大腸桿菌的特異性IgY，免疫后抗體最高效價(jià)達(dá)1.6×105.本實(shí)驗(yàn)中采用水稀釋卵黃使脂蛋白沉淀，經(jīng)微孔過(guò)濾去除脂蛋白沉淀，采用鹽析技術(shù)提取IgY并用親和柱純化IgY.在制備WSF后，用硫酸銨和硫酸納兩步鹽析提取，純度可達(dá)89.9%，回收率也接近50%，適合于IgY的大規(guī)模制備.用親和層析后，純度高達(dá)96.87%，蛋白質(zhì)產(chǎn)率為25.8%，此法既簡(jiǎn)單，又方便操作，適合于實(shí)驗(yàn)室分析研究.

參考文獻(xiàn)

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