謝 萌，朱文華，林宇恒，楊明瑜，馬秋敏，田慧琴，曲桂芹

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

基因沉默是近幾年發(fā)展起來的一項研究生物基因組功能的新技術。在植物基因組研究中，較常用的基因沉默技術有反義基因技術、轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術（Post－transcriptional Gene Silencing,PTGS）和病毒介導的基因沉默（Virus－induced Gene Silencing,VIGS）技術。本試驗所用的ihpRNA（Intronspliced hairpin RNA）沉默技術是對PTGS的改進，利用帶有發(fā)夾結構的雙鏈RNA高效率的誘導靶基因沉默。由此方法構建的沉默載體的特征是在內(nèi)含子（Intron）片段兩端反向連接靶基因，在轉(zhuǎn)錄過程中獲得具有發(fā)夾結構的RNA。ihpRNA技術對抗病毒或內(nèi)源基因，幾乎以百分之百的效率誘發(fā)PTGS[1]。此外，經(jīng)此方法獲得的基因沉默性狀具有可遺傳性[2－3]。

Bax inhibitor－1（BI－1）基因是少數(shù)幾個存在于真核生物中的細胞程序性死亡的調(diào)控因子。因此，它被認為是在真核生物進化過程中一個非常古老的細胞程序性死亡的調(diào)控因子[4－6]。已有許多試驗現(xiàn)象表明在植物中BI－1調(diào)節(jié)了脅迫反應和細胞凋亡：當植物中積累H2O2和其他的防御物質(zhì)時，番茄BI－1的表達被誘導[7]；在含有稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的細胞壁中分離細胞制備物進行細胞培養(yǎng)時，水稻BI－1的調(diào)控發(fā)生在下游[8]；當用2，6－二氯異煙酸處理大麥誘導抗病性時，出現(xiàn)了BI－1表達量降低的現(xiàn)象[9]；在衰老的花中以及大麥葉子中顯示出BI－1表達量增加[10]。由此可知，BI－1在植物發(fā)育及脅迫反應中具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室提供，載體pGSA1285、pFGC5941購自美國 Arabidopsis Imformation Resource（TAIR）公司。

1.1.2 酶及試劑

限制性內(nèi)切酶購自NEB；T4DNA連接酶購自Promega公司；PCR相關試劑購自大連寶生物工程有限公司；其他常用化學藥品為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

質(zhì)粒DNA提取、電泳、酶切、菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化等操作參見文獻[11]。瓊脂糖凝膠中DNA片段的回收參見試劑盒說明。

1.2.1 連接反應

將載體DNA和外源DNA片段加入滅菌的離心管中，物質(zhì)的量比為3∶1，加入10×T4DNA連接酶緩沖液 2 μL，T4DNA連接酶1 μL，用水補足至20 μL，離心混勻。16℃連接4 h后，4℃連接過夜。

1.2.2 限制位點的引入

利用PCR擴增技術，在BI－1基因的5′端引入XhoⅠ和PacⅠ的限制位點，3′端引入AscⅠ和Bam HⅠ的限制位點。

5′引物為：5′CTCGAGTTAATTAAATGGAGTC TTGCACATCGTTCT 3′；

3′引物為：5′CGGGCGCGCCGGATCCTGTTCT CCTCTTCTTCTTC 3′。

熱循環(huán)參數(shù)為：94℃變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次后，于72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物連接pGEM－T－easy載體，轉(zhuǎn)化、篩選、酶切測序鑒定。

1.2.3 重組農(nóng)桿菌質(zhì)粒的PCR檢測和回復動員試驗

采用電擊轉(zhuǎn)化方法將BI－1沉默載體質(zhì)粒pGSA4285及空載pGSA2285導入根癌農(nóng)桿菌EHA105。挑取電轉(zhuǎn)化后在抗性培養(yǎng)基上生長的農(nóng)桿菌菌落，在含氯霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24 h，采用堿裂解法提取質(zhì)粒。用BI－1基因特異性引物進行PCR擴增。

提取經(jīng)PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌質(zhì)粒，采用熱激法直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含有50 μg·mL－1Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～18 h，平板上出現(xiàn)白色菌落。挑取單菌落，質(zhì)粒酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 BI－1沉默載體的構建

2.1.1 pGSA1285載體的改造

用AscⅠ與Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pFGC5941，回收約1.3 kb的CHSA Intron基因片段；用AscⅠ與Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pGSA1285，回收約9.5 kb的載體片段。將兩個片段連接，獲得重組質(zhì)粒。這樣，首先向載體中引入了ihpRNA沉默所需的Intron片段。用AscⅠ與Bam HⅠ雙酶切鑒定，切出了1.3 kb的片段，證明是所需的含intron片段的重組質(zhì)粒，命名為pGSA2285（見圖1、2）。

2.1.2 煙草BI－1基因反向插入載體pGSA3285的構建

用PacⅠ與Bam HⅠ雙酶切含有BI－1基因的pGEM－T質(zhì)粒，回收約750 bp的BI－1基因片段；用PacⅠ與Bam HⅠ雙酶切質(zhì)粒pGSA2285，回收約10.8 kb的載體片段。將兩個片段連接，獲得重組質(zhì)粒。這樣，在Intron片段的下游反向插入了BI－1基因。用PacⅠ與Bam HⅠ雙酶切鑒定，得到750 bp的片段，證明是目的基因反向連接的重組質(zhì)粒，命名為pGSA3285（見圖3、4）。

圖1 pGSA2285的構建策略Fig.1 Strategy of constructing plasmid pGSA2285

圖2 載體pGSA2285的酶切分析Fig.2 Restriction endonuclease analysis of vector pGSA2285

圖3 載體pGSA3285的酶切分析Fig.3 Restriction endonuclease analysis of vector pGSA3285

圖4 pGSA3285的構建Fig.4 Strategy of constructing vector pGSA3285

2.1.3 ihpRNA沉默載體pGSA4285的構建

結果見圖5、6。

用AscⅠ與XhoⅠ雙酶切含有BI－1基因的pGEM－T質(zhì)粒，回收約750 bp的BI－1基因片段；用AscⅠ與XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pGSA3285，回收約11.8 kb的載體片段。將兩個片段連接，獲得重組質(zhì)粒。這樣，就構建成了能轉(zhuǎn)錄出ihpRNA的沉默載體pGSA4285。用PacⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定，得到2.8 kb的片段，證明是所需的含有發(fā)夾結構的沉默載體。

圖5 pGSA4285的構建Fig.5 Vector pGSA4285 constructing

圖6 載體pGSA4285的酶切鑒定Fig.6 Restriction endonuclease analysis of vector pGSA4285

2.2 pGSA4285植物表達載體導入農(nóng)桿菌后質(zhì)粒PCR鑒定及農(nóng)桿菌質(zhì)粒回復動員酶切鑒定

提取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，以BI－1基因序列特異性引物對提取的質(zhì)粒進行PCR檢測，可擴增出750 bp左右的片段（見圖7），初步表明BI－1植物沉默載體pGSA4285轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。提取經(jīng)PCR鑒定為陽性的農(nóng)桿菌質(zhì)粒，需進一步酶切鑒定，但農(nóng)桿菌質(zhì)粒酶切困難。如果重新轉(zhuǎn)入大腸桿菌，再提取質(zhì)粒酶切就容易得多。分別將PCR檢測為陽性的農(nóng)桿菌質(zhì)粒pGSA2285和pGSA4285分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取大腸桿菌質(zhì)粒，酶切鑒定結果見圖8，泳道中的1、2為空載pGSA 2285，經(jīng)XhoⅠ與PacⅠ雙酶切切出1 300 bp大小左右的片段，而3～6為pGSA4285回復動員（即從抗性篩選的農(nóng)桿菌中提取pGSA2285質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌）質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ與PacⅠ雙酶切切出2 800 bp大小的片段，符合hpRNA沉默載體中插入的正向和反向煙草BI－1基因大小，從分子水平證明煙草BI－1 hpRNA沉默載體構建成功。

圖7 農(nóng)桿菌中pGSA4285質(zhì)粒的PCR檢測Fig.7 PCR confirmation of plasmid pGSA4285 in Agrobacterium tumefaciens

圖8 載體pGSA4285的回復動員酶切鑒定Fig.8 Restriction endonuclease analysis of vector pGSA4285

3 討論與結論

作為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術，RNA沉默技術已廣泛應用于動植物基因組的研究中。它通過轉(zhuǎn)入雙鏈的外源RNA在植物體內(nèi)降解為21～23 bp的小干擾RNA（siRNA），誘導內(nèi)源特異性mRNA降解[11]。植物體在不同的生物或非生物脅迫下，表現(xiàn)出RNA沉默機理的復雜性。但可以肯定的是RNA沉默是由雙鏈RNA誘發(fā)的。雖然單鏈正義RNA、單鏈反義RNA以及雙鏈RNA在植物體內(nèi)都可誘導基因沉默，但雙鏈RNA尤其是發(fā)夾式結構的RNA（hpRNA）的沉默效果最好。沉默載體的優(yōu)化試驗進一步證明，如果在發(fā)夾結構的反向重復序列間加入一段可在前體mRNA加工過程中被剪切去除的內(nèi)含子，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成沒有環(huán)的hpRNA，其沉默效率可達到90%以上，甚至是100%[1]。此效應的原理可能是由于轉(zhuǎn)錄過程中中間序列的切除，使反向序列接近，空間上易于形成雙螺旋結構，形成雙鏈RNA。本試驗即依據(jù)此原理構造反向重復序列之間有一段內(nèi)含子的沉默載體。

現(xiàn)今通過hpRNA技術構造沉默載體，通常分兩次在插入片段兩端各連接一個互不相同的酶切位點，實現(xiàn)定向克隆，以構建含有反向重復序列的沉默載體。但此方法需要構造兩次插入基因、兩次測序比對，比較繁瑣且耗時較長。本試驗中，嘗試直接在插入基因的上下游各連接兩種酶切位點，從而使試驗過程和時間減少一半，提高試驗效率。雖然，引物長度的增加，一定程度上影響PCR的特異性和成功率，但通過對PCR過程中溫度和循環(huán)時間的控制，此方法現(xiàn)已獲得成功。

最新的研究表明，在植物體內(nèi)一種約21～23 bp的單鏈小分子RNA（miRNA）通過和siRNA相似的沉默途徑，不完全的特異性識別自己的靶基因位點，誘發(fā)基因沉默[12]。此發(fā)現(xiàn)使我們對RNA沉默的原理有了新的認識，至少可以確定，此過程在一定程度上促進了植物體中雙鏈RNA誘導的基因沉默。同時，因其識別靶位點并不是完全特異性的，單個沉默載體的作用位點范圍廣，或許會為基因沉默開辟一條新的途徑。對成功培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草還要進行生理學方面的試驗才可進一步了解BI－1在煙草細胞程序性死亡中的作用。

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