郭炳彥,石英輝,韓 瑞,韓德榮,李擁軍

心肌肥大是以心肌體積增加和蛋白質(zhì)含量增多為主要特征的生長異常,是引起多種心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)與多種生長因子均可促使心肌肥大的發(fā)生和發(fā)展,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在其中起著關(guān)鍵作用[1]。姜黃素是植物姜黃的主要成分,其藥理學(xué)研究已有百年歷史,姜黃素具有抗炎、抗氧化、降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[2-4],臨床上可用于冠心病的治療。但其對心肌肥大的作用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞研究姜黃素對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及ERK表達(dá)的影響,探討姜黃素此作用的可能機(jī)制,為其在臨床用于防治心肌肥大提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 出生1 d～3 d Sprague-Dawley大鼠,河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,清潔級,質(zhì)量許可證號:SCXK(冀)2008-1-003,雌雄不限;DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),AngⅡ(Sigma公司,美國),胰蛋白酶(Sigma公司,美國),膠原酶Ⅱ(Invitrogen公司,美國),ERK1/2抗體(購自武漢博士德公司),姜黃素(北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),純度大于 95.5%),其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2 新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取1 d～3 d新生Sprague-Dawley大鼠,在超凈工作臺上常規(guī)手術(shù)取心室肌組織,用4℃D-Hanks液洗凈殘血,將心室肌剪碎,用0.1%胰蛋白酶加0.04%膠原酶Ⅱ連續(xù)消化成單細(xì)胞懸液,所有心肌細(xì)胞原液經(jīng)200鉬細(xì)胞篩過濾,差速貼壁1.5 h,將未貼壁的心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×108/L,并加入0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌細(xì)胞增殖,然后將細(xì)胞均勻地接種于 6孔培養(yǎng)板,每孔2 mL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,然后換無血清培養(yǎng)液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 乳鼠心肌細(xì)胞于無血清DM EM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,分成 3組,對照組、AngⅡ組(10-6mol/L)、姜黃素組(AngⅡ10-6mol/L+姜黃素2.5×10-8g/L)。

1.4 心肌細(xì)胞蛋白合成速率測定 心肌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后,加入各種干預(yù)因素和18.3 kBq[3H]-亮氨酸繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。棄培養(yǎng)液,PBS沖洗3遍,用 0.1%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞于玻璃纖維素膜上,用10%的三氯乙酸固定,濾膜烘干后用LS-3810液體閃爍儀測定摻入量。

1.5 心肌細(xì)胞蛋白的提取 終止細(xì)胞培養(yǎng),將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出,用預(yù)冷PBS洗培養(yǎng)物3次,棄去PBS。用細(xì)胞刮棒刮培養(yǎng)孔底部,將貼壁細(xì)胞刮下來用冰PBS收集以1 500 r/min～3 000 r/min離心6 min～10 min,去上清。向沉淀加入心肌細(xì)胞裂解液100 μ L和 PMSF 1μL,冰上裂解30 min,每10 min吹打一次。12 000 r/min離心15 min,移上清于1 mL的EP管中,-80℃冰箱保存。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測ERK1/2蛋白表達(dá) 用Bio-Rad的蛋白定量試劑盒測蛋白濃度,完畢后將之加入5×SDS加樣緩沖液中煮沸5min,以使蛋白質(zhì)樣品變性,然后置于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ?2%十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白,用電轉(zhuǎn)移方式將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,用含5%脫脂奶粉的 TBST封閉1 h,加入一抗(1∶1 000),4℃過夜,次日用 TBST洗 3次后,加入二抗(1∶2 000),孵育1 h,TBST洗3次,ECL發(fā)光,壓膠片曝光,對所得條帶進(jìn)行掃描。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞蛋白合成速率 AngⅡ組(2 282.32 cpm±245.48 cpm)較對照組(1 313.64 cpm±202.58 cpm)顯著增加(P＜0.01),姜黃素組(1 761.62 cpm±212.44 cpm)較 AngⅡ組顯著降低(q=48.42,P＜0.01)。

2.2 各組心肌細(xì)胞 ERK1/2的表達(dá) AngⅡ組ERK1/2(456.5±8 3.3)表達(dá)較對照組顯著增加(190.5±25.3,θ=35.14,P＜0.01),而姜黃素組較AngⅡ組顯著降低(216.2±19.6,θ=19.64,P＜0.01)。

3 討 論

血管緊張素Ⅱ作為一個(gè)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子,不僅能夠控制心血管系統(tǒng)的生理功能,對心肌肥大或心力衰竭的病理生理過程也能起到至關(guān)重要的作用。MAPK通路是一條重要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)[5]。它主要包括ERK、應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK)、p38MAPK 3種;ERK途徑是細(xì)胞生長、分化與存活等過程的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,其中ERK1/2與心肌細(xì)胞肥大關(guān)系最為密切[6],ERK主要由Raf通過Ras激活,磷酸化ERK是其活化形式。其活化后轉(zhuǎn)位到核內(nèi),作用于下游的轉(zhuǎn)錄因子 ELK、AP-1、NF-κ B等,調(diào)節(jié)引起心肌肥大相關(guān)的基因(如c-fos、c-myc、c-jun)的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可誘導(dǎo)ERK磷酸化,從而活化ERK通路引起心肌肥大反應(yīng)的發(fā)生。延緩由細(xì)胞外信號引起的肥大進(jìn)程是任何控制肥大的治療措施的關(guān)鍵[7]。姜黃素是從植物姜黃、郁金、莪術(shù)等植物根莖中提取的一種生物多酚化合物。具有行氣破血、消積止痛、清心解郁等功效。具有抗氧化和清除自由基、抗血小板、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抑制血栓形成等廣泛的藥理作用,并且具有肝臟及腎臟保護(hù)功能,毒副反應(yīng)小。姜黃素還可改善壓力超負(fù)荷兔的心功能[8]。因而推測姜黃素在治療心力衰竭等心血管疾病方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果顯示,AngⅡ可顯著增加新生大鼠心肌細(xì)胞蛋白合成速率,而姜黃素可顯著抑制心肌細(xì)胞蛋白合成速率,說明姜黃素可抑制AngⅡ所致的心肌細(xì)胞肥大。AngⅡ可顯著增加心肌細(xì)胞ERK1/2的表達(dá),姜黃素使ERK1/2表達(dá)顯著降低,說明姜黃素可能通過降低胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子ERK1/2的表達(dá),實(shí)現(xiàn)防止心肌細(xì)胞肥大的作用。下一步研究要著重于姜黃素對ERK信號通路的上下游分子的影響,進(jìn)一步闡明姜黃素抗心肌肥厚的機(jī)制,為其在臨床用于心肌肥厚的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

姜黃素可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞核內(nèi)信息分子ERK1/2的表達(dá),這可能是姜黃素抗心肌肥大的重要機(jī)制之一。

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