田 玨,李曉宇,張?zhí)K麗,杜蕓輝,王 可,劉慧榮

心臟組織凋亡增加是衰老心臟心功能降低,并對(duì)損傷刺激(如心肌缺血再灌注)的易感性增加的主要原因之一[1,2],但凋亡增加的機(jī)制不完全清楚。近年來(lái)研究表明,源于一氧化氮(NO)的活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)是細(xì)胞損傷的重要介質(zhì),RNS具有促凋亡和抗凋亡的雙重作用,普遍認(rèn)為低濃度NO具有細(xì)胞保護(hù)作用;高濃度的NO及其與超氧化物的雙自由基反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧亞硝基(ONOO-)具有細(xì)胞毒性[3-6]。衰老心臟NO含量較成年增高[7],但這種增高的病理生理意義并不清楚,特別是NO的這種增高是否能導(dǎo)致衰老的心肌組織中ONOO-增高,進(jìn)而使衰老的心臟凋亡增加則有待進(jìn)一步研究。本研究探討了衰老心臟活性氮簇的改變及其與衰老心臟凋亡增加的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠,成年大鼠(4～6)月齡,衰老大鼠(22～24)月齡,購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 心肌組織Caspase-3活性分析 取心肌組織樣品,每1 mg組織加入裂解液 10 μ L,置冰上剪碎,勻漿,離心。取上清,一部分用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度;一部分測(cè)定Caspase-3活性。取30μ L上清,65 μ L 反應(yīng)緩沖液,5μ L底物(DEVD-pNA)加至96孔ELISA板中;背景對(duì)照孔除不加底物外,余同實(shí)驗(yàn)孔,用反應(yīng)液將每孔的液體補(bǔ)齊至100μ L。37℃水浴1.5 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。結(jié)果以比活性反應(yīng)心肌組織中Caspase-3的活性。

1.3 Western-blot測(cè)定VASP和p-VASP的蛋白表達(dá) 稱取心肌組織的重量,按照1 mg組織加入10μL裂解液的比例制備組織勻漿,提取上清,利用SDS-PAGE電泳技術(shù)分離勻漿組織中的蛋白,再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用VASP、pVASP單克隆抗體(A.G.Scientific,Inc),免疫印跡檢測(cè)心肌組織VASP、pVASP含量。

1.4 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)心肌組織硝基酪氨酸含量BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將抗硝基酪氨酸單克隆抗體(Upstate Biotechnology)以每孔100 μ L加入酶標(biāo)板,4°C孵育過(guò)夜,次日棄去上清。將 5%BSA-PBS加入 ELISA板,每孔 100 μ L,37℃孵育2 h后棄去上清。將不同濃度的硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及心肌組織樣品上清分別加入酶標(biāo)板,將兔源性抗硝基酪氨酸多克隆IgG抗體(Upstate Biotechnology)加入酶標(biāo)板,加入標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定光密度(OD)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩樣本均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn),兩個(gè)連續(xù)型隨機(jī)變量間的關(guān)聯(lián)性采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 衰老大鼠心肌組織Caspase-3比活性 與成年大鼠(1.000±0.028)相比,衰老大鼠Caspase-3的比活性為(2.210±0.327,P＜0.01),顯著增高。

2.2 衰老大鼠心肌組織pVASP蛋白表達(dá) 衰老大鼠心肌組織中的總VASP蛋白表達(dá)與成年大鼠相接近,但pVASP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。

2.3 衰老大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量 與成年大鼠的心肌組織硝基酪氨酸(0.858±0.143)ng/mL相比,衰老大鼠的硝基酪氨酸含量明顯升高(1.545±0.194)ng/mL(P＜0.05),說(shuō)明衰老大鼠心肌組織中有大量過(guò)氧亞硝基產(chǎn)生。

2.4 心肌組織硝基酪氨酸含量與Caspase-3活性相關(guān)性分析大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量與Caspase-3活性呈正相關(guān)(r=0.749,P＜0.01),即隨著硝基酪氨酸含量增高,Caspase-3活性相應(yīng)增加。衰老大鼠心肌組織凋亡的增加可能與其硝基酪氨酸含量增高有關(guān)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示衰老大鼠凋亡明顯增加,心肌組織中的總VASP與成年大鼠相接近,但pVASP水平明顯降低。衰老大鼠心肌組織中硝基酪氨酸較成年大鼠明顯升高,相關(guān)性分析顯示大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量與Caspase-3活性呈正相關(guān)。

大量資料提示衰老心臟對(duì)疾病的易感性增加。這可能與衰老心臟心肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。因?yàn)樾募〖?xì)胞是終末分化細(xì)胞,凋亡的增加必然使心肌細(xì)胞減少而減弱心臟的泵功能,引起電傳導(dǎo)不均一,而發(fā)生心律失常以及使周圍心肌細(xì)胞重排導(dǎo)致心肌重構(gòu)等從而引起廣泛的機(jī)械、電活動(dòng)障礙。研究發(fā)現(xiàn),人類和動(dòng)物衰老過(guò)程中出現(xiàn)大量心肌細(xì)胞丟失[8];70歲健康男性僅由衰老導(dǎo)致的心肌細(xì)胞丟失就占左右心室細(xì)胞總數(shù)的30%[9]。Kajstura等[10]發(fā)現(xiàn),在衰老大鼠中,凋亡比壞死更為普遍。但衰老心肌組織凋亡增加的機(jī)制不完全清楚。衰老心臟NO含量較成年增高,而且高濃度的NO及其與超氧化物的雙自由基反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)氧亞硝基具有細(xì)胞毒性,其與衰老心肌凋亡增加是否有關(guān)有待研究。如能揭示衰老時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加的潛在機(jī)制,或許可為扭轉(zhuǎn)這種細(xì)胞丟失提供指導(dǎo)。

VASP由 Halbrugge和Walter首次提出[11],它是血小板中一種主要的磷酸化蛋白質(zhì)。最近的研究表明:VASP是cAM P和cGMP依賴性蛋白激酶下游的靶物質(zhì),磷酸化VASP(pVASP)的表達(dá)量可用于監(jiān)測(cè) NO/cGM P信號(hào)通路[12,13]。pVASP降低表明NO的生物利用度降低,提示還存在其他化學(xué)或生化反應(yīng)與正常NO/cGMP活化通路相競(jìng)爭(zhēng)。目前已明確的能與 cGMP競(jìng)爭(zhēng)NO的分子是˙O2-,˙O2-可與NO生成具有細(xì)胞毒性的ONOO-,因此比較衰老與成年大鼠心肌中的ONOO-水平。ONOO-極不穩(wěn)定,很容易降解,因此無(wú)法直接檢測(cè)其含量。組織硝基酪氨酸形成是體內(nèi)ONOO-形成的印跡和標(biāo)志,其含量可以直接反映ONOO-的水平,衰老大鼠心臟硝基酪氨酸明顯增高,而相關(guān)性分析表明心肌組織中ONOO-的含量與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到,衰老心肌組織NO生物利用度明顯降低,衰老心臟中增加的NO大多生成為具有細(xì)胞毒性的ONOO-,毒性的ONOO-使得衰老心臟凋亡增加。提示或許可通過(guò)使用ONOO-解毒劑來(lái)減少衰老心肌的凋亡,而衰老心臟ONOO-升高的機(jī)制則有待進(jìn)一步研究。

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