王麗娟 孫彩玉 牛 德 秦智偉

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜抗霜霉病的分子生物學(xué)研究進展

王麗娟1孫彩玉1牛 德1秦智偉2*

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

黃瓜霜霉?。–ucumber downy mildew）是由真菌門鞭毛菌亞門古巴假霜霉菌侵染引起的一種世界性病害，已有70多個國家的黃瓜生產(chǎn)受其危害。本文從抗性遺傳、分子標記及圖譜構(gòu)建、抗霜霉病基因相關(guān)的分離等方面綜述了黃瓜抗霜霉病的分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究進展，并就分子水平研究中存在的問題進行探討，對今后的研究方向進行了展望。

黃瓜霜霉病；抗性遺傳；分子標記；連鎖圖譜；綜述

黃瓜（Cucumis sativus L.）霜霉病是危害黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一，已有70多個國家的黃瓜受其危害。有關(guān)黃瓜霜霉病的研究很多，主要集中在病原菌、發(fā)病規(guī)律、生理生化變化以及防治研究等傳統(tǒng)生物學(xué)方面。近年來，關(guān)于黃瓜抗霜霉病的分子生物學(xué)研究日益增多，在抗性遺傳、抗病基因分離、分子標記及連鎖圖譜構(gòu)建等方面取得了不少進展和成果。

1 黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律的研究

Cochran（1983）通過雜交分析證明黃瓜抗病性由數(shù)個基因決定；Jenkins（1946）認為抗病黃瓜品種Chinese Long和Puerto Rico37的抗性是由1個或2個主效基因和1個或多個微效多基因控制；Shimizu等（1962，1963）、Thomas等（1988）則認為黃瓜抗病品種Aojihai的抗性是由3對隱性基因控制的，并且這3對基因與控制果皮深綠的基因連鎖，Doruchowski和Lakowska（1992）也證明黃瓜對霜霉病的抗性是由3對隱性基因dm-1、dm-2和dm-3決定的；呂淑珍等（1990，1995）研究認為，霜霉病抗性至少由3對基因控制，具有部分顯性，其廣義遺傳力為62.33 %，狹義遺傳力為47.74 %，屬于遺傳力較高的性狀，容易穩(wěn)定；張素勤等（2007a）通過研究認為霜霉病抗性是由2對主基因和多個微效基因共同控制的，黃瓜對霜霉病的抗性，以加性效應(yīng)為主，主基因遺傳力較高，但是微效多基因效應(yīng)也不容忽視；白智龍等（2008）以抗霜霉病黃瓜品種S94（華北型）和感霜霉病純系品種 S06（歐洲型）為材料，確定霜霉病抗性屬于數(shù)量遺傳性狀，由至少4個位點調(diào)控，并推測該多效位點可能與報道的質(zhì)量性狀位點（dm）有關(guān)；劉玉石和丁九敏（2008）同樣經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)黃瓜抗性遺傳以基因的加性效應(yīng)為主，非加性效應(yīng)次之；張勝菊和司龍亭（2009）通過全輪配雙列雜交試驗表明，黃瓜霜霉病抗性至少受2對基因控制，且隱性等位基因較顯性等位基因占優(yōu)勢。

但也有報道認為黃瓜抗霜霉病基因是由一單隱性基因（dm）控制。例如，van Vliet等（1974，1977）認為黃瓜抗病品種PI197087的抗性由一個單隱性基因控制，并且認為這個基因與抗白粉病的基因連鎖；丁國華（2004）研究認為，黃瓜霜霉病抗感性狀分離比符合1∶3，表明黃瓜對霜霉病的抗性由1對隱性基因控制；另外也還有不少報道持相同的觀點（Fanourakis & Simon，1987；Pierce ＆ Wehner，1990；Horejsi et al.，2000）。

2 黃瓜抗霜霉病基因的分子標記和連鎖圖譜的研究

黃瓜是一種基因組較小的作物，約為3×105kb。高密度的黃瓜連鎖圖譜應(yīng)有7個連鎖組，覆蓋基因組范圍為750～1000 cM（Staub ＆Meglic，1993）。從早期的利用形態(tài)學(xué)標記構(gòu)建圖譜到目前的以分子標記為主構(gòu)建圖譜，所構(gòu)建的黃瓜遺傳圖譜已達到22張之多。其中有4張抗霜霉病基因常被用作抗病標記位點，包括van Vliet和Meysing（1974）、Kennard等（1994）、Meglic和Staub（1996）、Horejsi等（2000）。丁國華（2004）、張素勤等（2007b）同樣對黃瓜抗霜霉病基因進行標記，但標記后的連鎖距離始終不夠緊密。Horejsi等（2000）通過對960個RAPD引物篩選，在兩個抗、感霜霉病群體中找到了5個與dm基因緊密連鎖的RAPD標記，其中BC5191100與dm的連鎖距離最近，達9.9 cM；Kennard等（1994）也曾獲得過一個連鎖距離為9.5 cM的RFLP標記；國內(nèi)丁國華等（2007a）獲得了RAPD標記SBSP18-561與dm連鎖距離為10.54 cM；隨后，又采用RAPD技術(shù)轉(zhuǎn)SCAR的方法篩選黃瓜抗霜霉病基因分子標記，在318條RAPD引物中有18條引物表現(xiàn)出兩親本間多態(tài)性，其中引物 P18擴增片段與霜霉病抗病基因之間緊密連鎖，根據(jù)交換率和Kosambi函數(shù)公式計算其遺傳距離為7.85 cM。同時，研究表明:抗霜霉病基因dm與控制果實綠色的基因D和抗白粉病基因pm有緊密的連鎖關(guān)系（van Vliet & Meysing，1974；Meglic & Staub，1996；張素勤 等，2007b），并計算出dm和pm的遺傳距離為29.1 cM（丁國華，2004）。

3 黃瓜植株抗霜霉病相關(guān)基因的研究

由于抗病基因往往存在著一些保守的相似結(jié)構(gòu)域（Ellis et al.，1995；Lawrence et al.，1995），因此根據(jù)這些相似序列設(shè)計簡并引物，從植物基因組中得到的擴增產(chǎn)物與抗病基因有著較高的同源性，并且這些擴增產(chǎn)物往往與抗病基因緊密連鎖，或者是抗病基因的一部分（丁國華，2004）。由于獲得抗病基因同源序列（RGA）相對容易，因此目前對于抗霜霉病基因的克隆通常以此為入口。丁國華等（2004，2005）利用簡并引物從抗霜霉病黃瓜品種基因組 DNA中分離得到多條核苷酸結(jié)合位點（NBS）類型RGA，通過核苷酸和氨基酸序列的比對，顯示其與已報道的甜瓜RGA有較高的同源性，所克隆的黃瓜RGA基本都含有NBS保守域中P-loop和kinase2保守序列，有些還包含kinase3a特征保守結(jié)構(gòu)甚至NBS保守域的全部4個特征結(jié)構(gòu)；而隨后獲得的RGA與煙草的N基因、亞麻的L6基因和擬南芥的RPS2基因存在較高同源性，并且發(fā)現(xiàn)有些RGA在黃瓜品種間還表現(xiàn)出多態(tài)性（丁國華 等，2007b）；曹清河（2006）從抗病黃瓜品種中獲得了與抗霜霉病相關(guān)的基因序列cpc-1，通過半定量RT-PCR表達分析，發(fā)現(xiàn)此基因序列在根、莖和葉中都表達，其表達量的大小順序為:葉>莖>根；李金鑫（2008）從抗霜霉病黃瓜葉片中分離出4條與黃瓜霜霉病抗性相關(guān)的特異表達基因，分別為49-2、50-2、50-7和52-14，研究表明:在抗霜霉病黃瓜受誘導(dǎo)后，這4個基因的表達具有一定的時間和空間差異性，序列比對分析表明，50-7與黃瓜脂氧合酶基因高度同源，其他3個基因為未知新基因。牛德（2009）建立了霜霉菌侵染的黃瓜葉片cDNA文庫，通過對所構(gòu)建的cDNA文庫的分析，共發(fā)現(xiàn)有427條基因參與植物防御/抗病過程，所得到的2507條非重復(fù)序列（unigenes）在NCBI、Swiss-Prot、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫比對，確定了468條unigenes為新基因，是以后重點研究對象。

4 問題與展望

在抗性遺傳方面，由于不同研究者所使用的試驗材料不同，或抗病性鑒定方法和分級標準存在差異，因而得出不同結(jié)論。因此，確定統(tǒng)一的實驗標準還是必要的。另外，若存在霜霉菌生理小種分化，而不同的實驗者如使用不同的霜霉菌生理小種來進行試驗，所得到的結(jié)果可能也會存在差異。在抗病基因的分子標記方面，其標記還未達到理想距離，標記點連鎖距離始終不夠緊密。在黃瓜抗霜霉病基因方面爭議較大，主要是圍繞主效基因和微效基因、顯性基因和隱性基因的控制方面。對于抗霜霉病相關(guān)基因的功能驗證研究相對不多，其中存在諸多困難，包括基因的不確定性、黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化率不高等問題，因此篩選更為精確的黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因、優(yōu)化黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系是黃瓜抗霜霉病研究的重點和難點，在相關(guān)基因的功能驗證方面還有大量工作需要完成。

黃瓜全基因組測序已完成，為黃瓜抗霜霉病的研究提供了重大幫助。分離黃瓜抗霜霉病相關(guān)基因，利用分子育種手段培育高抗黃瓜霜霉病品種，是黃瓜霜霉病分子生物學(xué)研究的最終目標。

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Progress in Molecular Biology Research on Cucumber Downy Mildew

WANG Li-juan1, SUN Cai-yu1, NIU De1, QIN Zhi-wei2*
（1College of Life Science，Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China; 2College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin150030, Heilongjiang, China）

Cucumber downy mildew is a worldwide disease caused by Pseudoperonospora cubensis.It is known around the world that more than70 cucumber（Cucumis sativus L.）producing countries were under its hazards. This paper expounds the research progress made in the field of molecular biology in resistance to cucumber downy mildew from resistance genetics, construction of molecular marker and linkage map, separation related to resistance to downy mildew genes. The paper also discusses about the existing problems in molecular level research, and outlooks the future research orientation.

Cucumber downy mildew; Resistance genetics; Molecular markers; Linkage map;Review

S642.2

A

1000-6346（2010）24-0010-04

2010-07-23；接受日期:2010-10-30

黑龍江省博士后專項科研基金資助項目（LBH-Z07213）

王麗娟，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:植物胚胎發(fā)育與分子生物學(xué)，E-mail:lj_wang@163.com

*通訊作者（Corresponding auther）:秦智偉，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:蔬菜遺傳育種，E-mail:qzw303@126.com