李 瀟盧 瑤

高分辨率熔解曲線分析技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展

李 瀟①盧 瑤②*

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技術(shù)發(fā)揮著重要作用。

高分辨率熔解曲線；基因；突變

[First-author's address]China Medical University,Shenyang 110001, China.

隨著現(xiàn)代科學(xué)的不斷發(fā)展與人類疾病譜的不斷擴(kuò)大，各種疾病在基因水平的研究越來越成為科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)。雖然目前已有許多技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如直接測(cè)序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、基因芯片、基因探針等，但都始終存在著通量小、操作復(fù)雜、易受污染等種種缺點(diǎn)，HRM技術(shù)的誕生解決了上述難題。

1 高分辨率熔解曲線

HRM分析技術(shù)是2002年由猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)，最初應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）檢測(cè)分析的一項(xiàng)新技術(shù)[1]。它是在PCR結(jié)束后，根據(jù)不同堿基序列構(gòu)成核苷酸熔解溫度不同這一物理性質(zhì)，在同一容器中直接進(jìn)行高分辨率熔解，利用飽和染料監(jiān)控核苷酸的熔解過程，得到特征性熔解曲線，再根據(jù)熔解曲線的形態(tài)變化來判斷核苷酸性質(zhì)的差異。目前，HRM的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)擴(kuò)展到突變掃描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等諸多方面，近年來已成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)技術(shù)。

HRM利用PCR后擴(kuò)增子的核苷酸序列和長(zhǎng)度不同而引起的各堿基含量的差異，通過不同溫度下實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過程的熔解曲線來反映DNA鏈中單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的基因變化?？梢哉f，核苷酸的排列和配對(duì)堿基不同是其熔解溫度產(chǎn)生差異的根本原因。HRM通過這種實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，判斷升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況。雙鏈DNA如果某SNP位點(diǎn)不匹配，升溫過程中就會(huì)先解開，其熔解溫度反映在熔解曲線上就會(huì)相應(yīng)降低，根據(jù)熒光強(qiáng)度與溫度曲線就可以判斷是否存在SNP，而且不同基因位點(diǎn)、雜合子與否等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能有效區(qū)分不同位點(diǎn)的基因型。

2 HRM分析技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 SNP分析

不同個(gè)體同一條染色體上同一位點(diǎn)的核苷酸序列絕大多數(shù)是一致的，當(dāng)單個(gè)核苷酸堿基不同而導(dǎo)致核酸序列呈包括置換、缺失和插入等多態(tài)性時(shí)，稱單核苷酸多態(tài)性，即SNP。SNP現(xiàn)象在生物體內(nèi)廣泛存在，它是生物遺傳變異的表現(xiàn)之一，因而SNP對(duì)研究人類遺傳和進(jìn)化具有重要意義。

通過對(duì)比人群染色體上目的基因在溫度變化過程中的多態(tài)性，即體現(xiàn)在熔解曲線上的波形峰值差異，來分析人群中特定位點(diǎn)不同堿基所占比率與某一性狀或疾病的相關(guān)性，為進(jìn)一步的基因篩查，疾病預(yù)防以及臨床用藥指導(dǎo)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。Vossen RH等[2]通過HRM分析69名個(gè)體的MBL2（編碼一種先天免疫分子），發(fā)現(xiàn)了3處SNP位點(diǎn)，目前正在研究它們與炎癥和感染性疾病的相關(guān)性。通過對(duì)β地中海貧血患者的血紅蛋白進(jìn)行SNP檢測(cè)，可以高效準(zhǔn)確地判定疾病分型，有利于準(zhǔn)確進(jìn)行臨床診斷，避免誤診[3]。

也可以利用同一原理研究家族遺傳過程中某一疾病易感性或家族遺傳病是否與基因SNP有關(guān)，例如，當(dāng)CYP2C19基因存在明顯的遺傳多態(tài)性時(shí)，機(jī)體易患真菌感染性疾病[4]。若確定了相關(guān)性可以深入明確基因定位，并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，對(duì)提高人類整體質(zhì)量水平具有重要意義。

另有報(bào)道許多人類相關(guān)疾病與基因多態(tài)性的關(guān)系。例如Jin XM等[5]研究PARP-1基因上兩個(gè)SNP位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)SNP的五種多態(tài)性變化均可以不同程度地降低非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率。

2.2 突變掃描

HRM分析技術(shù)通過飽和染料監(jiān)控熔解曲線的變化，僅利用核酸的物理性質(zhì)對(duì)基因序列進(jìn)行精確分析?；谶@一原理，使HRM可以不受堿基突變位點(diǎn)和種類的局限，不僅能夠?qū)σ阎蛔冞M(jìn)行分析，而且對(duì)未知突變的篩查、掃描和短片段重復(fù)序列的分析也有理想的檢測(cè)效果。突變掃描運(yùn)用飽和染料，通過對(duì)比雜交雙鏈與野生型基因曲線的形狀差異來分析檢測(cè)位點(diǎn)的突變情況，這種曲線形狀的不同是由極微小的熔解溫度變化來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)比純合子的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線進(jìn)行基因突變檢測(cè)，就可以比較出突變位點(diǎn)之所在。

目前，利用HRM進(jìn)行突變掃描的應(yīng)用非常廣泛，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多由于基因突變而導(dǎo)致疾病發(fā)生的現(xiàn)象。Hill等[6]利用HRM對(duì)比13位慢性肉芽腫疾病患者和96位正常個(gè)體的CYBB外顯子時(shí)發(fā)現(xiàn)，此外顯子的19個(gè)突變位點(diǎn)與X連鎖慢性肉芽腫性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。利用HRM 進(jìn)行肺癌EGFR基因突變檢測(cè)可以顯著增加突變檢測(cè)的靈敏度，提高臨床診斷速率[7]。Yan JB[8]證明6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏病與C1311T/IVS插入突變有關(guān)，闡明了世界約有4億患者的最普遍的酶缺乏病之一的主要發(fā)病機(jī)制，為臨床靶向治療的研究提供理論依據(jù)。通過對(duì)結(jié)腸癌患者KRAS基因進(jìn)行掃描時(shí)，發(fā)現(xiàn)有40%的患者都有突變位點(diǎn)[9]。另外，Onq DC等[10]通過研究結(jié)核患者的ahpC基因，發(fā)現(xiàn)當(dāng)此基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生利福平和異煙肼（治療結(jié)核藥）抵抗，上述藥物對(duì)aphC基因突變的患者治療無效，這一發(fā)現(xiàn)為結(jié)核病的臨床用藥提供了價(jià)值。

應(yīng)用HRM技術(shù)檢測(cè)基因突變的報(bào)道還有很多，如RET基因，p53基因，苯丙氨酸羥化酶基因等，對(duì)這些基因突變的深入研究目前正在廣泛進(jìn)行，其研究結(jié)果在預(yù)防、診斷、治療方面將會(huì)發(fā)揮積極作用。

2.3 甲基化研究

DNA 甲基化是發(fā)生在DNA堿基序列上的一種共價(jià)修飾。靶序列上甲基基團(tuán)的存在可以影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，引起轉(zhuǎn)錄抑制，從而使該基因的表達(dá)受到抑制。DNA甲基化是表型遺傳修飾的重要組成部分，在細(xì)胞正常功能維持、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。HRM技術(shù)為DNA甲基化狀態(tài)的檢測(cè)另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例。

在哺乳動(dòng)物中，D N A甲基化主要發(fā)生在5-CpG-3雙核苷酸序列的胞嘧啶上。在人類基因組中，大約有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物種和細(xì)胞類型而異。啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化常常可以抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，尤其是對(duì)于抑癌基因，凋亡相關(guān)基因，DNA修復(fù)基因等，啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化會(huì)影響功能的發(fā)揮。不同的腫瘤組織基因甲基化狀態(tài)不同，可以作為早期檢測(cè)，監(jiān)測(cè)腫瘤形成的重要標(biāo)志。Snell C[11]應(yīng)用HRM技術(shù)證明了BRCA1和BRCA2基因啟動(dòng)子的甲基化水平與家族性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。

甲基化也可用于人類發(fā)育異常疾病的研究。如Angelman和 Prader-Willi綜合征，是兩種由于遺傳父系或母系的異常甲基化基因而導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育異常疾病。應(yīng)用HRM技術(shù)可以檢測(cè)由于甲基化水平過高引起的Beckwith-Wiedmann 綜合征和由于甲基化水平過低引起的Russell Silver 綜合征。在產(chǎn)前基因診斷方面，可以應(yīng)用HRM技術(shù)檢測(cè)ERG甲基化狀態(tài)作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合癥的基因標(biāo)記[12]。

2.4 基因分型

目前，雖然已經(jīng)有很多基因分型方法，但HRM閉管檢測(cè)在臨床檢驗(yàn)、針對(duì)性診斷和個(gè)性化藥物篩選等方面都有著很大的優(yōu)勢(shì)。早在1997年熔解曲線分析就已經(jīng)應(yīng)用于基因分型[13]，這種方法比基于等位基因特異性的方法優(yōu)越性更強(qiáng)，可以在一定跨度的變溫過程中同時(shí)區(qū)分不同等位基因。

人β球蛋白的HbC，HbS和HbE 3個(gè)基因型在113bp區(qū)域中，運(yùn)用以往的技術(shù)很難將它們區(qū)分開，Herrmann等[14]應(yīng)用HRM技術(shù)將β球蛋白的3個(gè)基因型分別檢測(cè)出來。Minucci A等[15]應(yīng)用HRM技術(shù)證明當(dāng)葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子區(qū)有純合的TA插入時(shí)，會(huì)導(dǎo)致膽紅素葡萄糖苷酸的大量減少，進(jìn)而發(fā)展成家族性非溶血性黃疸，他們對(duì)啟動(dòng)子區(qū)基因分型的研究成功對(duì)基因的靶向治療提供方向。

另外，HRM在人類(雙倍體)和微生物(單倍體)的基因分型中得到應(yīng)用的還有CDA、乳糖分解酵素、血色沉著病蛋白等。

2.5 序列匹配

在不需要完整的基因型，而只需知道DNA序列是否匹配的研究中，如：組織移植、親子鑒定、法醫(yī)鑒別等。通過l:1混合樣品進(jìn)行熔解曲線分析，如果樣品完全匹配，那么兩條熔解曲線在絕大多數(shù)重要參考位點(diǎn)應(yīng)完全吻合；如果樣品不完全匹配，就將形成不同雜合子而改變?nèi)劢馇€，由此可以通過這種方法來驗(yàn)證樣品的基因一致性。

在器官移植中，需要對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）進(jìn)行基因分型，主要涉及到HLA-A、B、C、DR等幾個(gè)位點(diǎn)。應(yīng)用高分辨率熔解進(jìn)行HLA序列匹配時(shí)，雖然兩個(gè)個(gè)體之間的七個(gè)共同的等位基因HLA-A具有高度多態(tài)性，HRM仍能夠快速進(jìn)行 HLA高度多態(tài)性位點(diǎn)的類型及非親源關(guān)系個(gè)體間異源造血干細(xì)胞移植前的HLA基因型確認(rèn)。

3 展望

飽和熒光染料的普及、未標(biāo)記探針與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)合，使得一個(gè)樣品能在一次分析中完成檢測(cè)、量化和基因分型等多方面的研究需要，若正確使用這個(gè)方法可以減少95%～99%的測(cè)序需要。而且HRM進(jìn)行突變掃描時(shí)是無損傷的，所以如果用HRM進(jìn)行一些樣本鑒定時(shí)，可使用同一樣本進(jìn)一步鑒定或進(jìn)行其他目的的實(shí)驗(yàn)而對(duì)結(jié)果無任何影響。綜上所述，HRM技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其是在臨床診斷方面具有相當(dāng)巨大的發(fā)展空間。將會(huì)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因檢測(cè)、食品安全、考古等諸多其他領(lǐng)域。

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High resolution melting curve analysis technology and application

LI Xiao,LU Yao

High-resolution melting curve (HRM) is a new genetic analysis technology based on single nucleotide polymorphism in the formation of different forms of melting curves.It has a very high sensitivity, which can detect single nucleotide differences. Meanwhile,it has a great deal of other advantages such as low cost, high throughput,rapid,accuracy and not subject to the limitations of testing sites which realizes closed tube operation.HRM analysis technology is playing an important role in the fields of mutation scanning,single nucleotide polymorphism analysis, methylation studies,genotyping, sequence matching and other aspects.The development of this method will surely have a far-reaching impact on the study of human genes.

High-resolution melting curve;Gene;Mutation

1672-8270(2010)08-0057-04

Q 754

B

李瀟,女，(1989- ),中國醫(yī)科大學(xué)臨床專業(yè)，本科在讀。

2010-05-11

①中國醫(yī)科大學(xué) 沈陽 110001

②中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心 沈陽 110001

*通訊作者：盧瑤,女，（1977-）博士，講師?，F(xiàn)就職于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，研究方向：分子生物學(xué)。 luyao@mail.cmu.edu.cn

China Medical Equipment, 2010,7(8):57-60.