王 宏,薛 原,2,張秀英

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌在抗生素的選擇壓力下耐藥菌株不斷產(chǎn)生,耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重,其中整合子是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因。它是細(xì)菌基因組中可移動(dòng)的遺傳物質(zhì),通過(guò)位點(diǎn)特異性重組捕獲外源基因盒(gene cassettes)并使之表達(dá),同時(shí)整合子可位于質(zhì)粒、染色體或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個(gè)組成部分而參與轉(zhuǎn)移,使細(xì)菌的耐藥性在病原菌中廣泛傳播。

1 整合子

1.1 整合子的結(jié)構(gòu) 自整合子-基因盒系統(tǒng)正式提出以來(lái),該系統(tǒng)目前對(duì)耐藥機(jī)制研究起了很大的作用,并已取得了較大的進(jìn)展[1]。

整合子基本結(jié)構(gòu)包括 5′保守末端(5′-CS)、3′保守末端(3′-CS)和兩者之間的可變區(qū)三部分。5′-CS是整合子的基本結(jié)構(gòu),包括編碼整合酶的基因(Int I)、整合子重組位點(diǎn)att I和整合子可變區(qū)啟動(dòng)子(Pant)。Int I屬于酪氨酸整合酶家族,催化基因盒在整合子重位點(diǎn)att I和基因盒重組位點(diǎn)attC之間的整合和剪切[2]。有的整合子在Pant下游還有啟動(dòng)子P2。可變區(qū)可插入編碼一些功能的基因?yàn)榭股啬退幓?被稱為基因盒。有的整合子在5′-CS和3′-CS之間沒(méi)有基因盒插入,插入的基因盒不能自身進(jìn)行表達(dá),必須借助于5′端的2個(gè)啟動(dòng)子。整合子的3′端的結(jié)構(gòu)因不同菌株和整合子類型不同而異,有的甚至沒(méi)有3′端結(jié)構(gòu)。

1.2 整合子的分類 整合酶基因(Int I)可以捕捉外來(lái)游離基因盒將其整合在整合子上,同時(shí)也可以將自身的基因盒切除,形成自由環(huán)狀片段[3]。目前根據(jù)整合酶的序列不同,至少已發(fā)現(xiàn)有10種整合子,其中6類整合子含有抗生素耐藥基因盒[4-5],但公開報(bào)道研究最多的整合子主要有4種。

Ⅰ類整合子最常見(jiàn),其5′-CS末端區(qū)有編碼整合酶的基因Int I及啟動(dòng)子Pant,部分還會(huì)有啟動(dòng)子P 2[6],3′-CS末端包括3個(gè)開放閱讀框(ORF),即磺胺耐藥基因(SulⅠ),季銨鹽化合物及溴化乙淀耐藥基因(qacE△1)及功能不明的ORF-5[7]。兩個(gè)片段之間區(qū)域可插入有編碼功能的基因盒。大多數(shù)Ⅰ類整合子的 5′-CS相似 3′-CS存在差異,通常存在于Tn21及與Tn21類似的轉(zhuǎn)座子上。此整合子陽(yáng)性株的耐藥率明顯高于整合子陰性株[8]。

Ⅱ類整合子存在于 Tn7或它的衍生物上,與IntI1有40%的同源性,其整合酶基因IntI2是缺陷的整合酶基因,不能催化基因盒的整合與剪切。目前僅發(fā)現(xiàn)核苷轉(zhuǎn)移酶基因aadA la、甲氧芐啶耐藥基因dfr及鏈霉素耐藥基因sat位于該類整合子上。

Ⅲ類在耐碳青霉烯類抗生素的粘質(zhì)沙雷菌的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的,其整合酶IntI3與IntI1有60.9%的同源性。Ⅲ類整合子攜帶編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因盒,且目前只發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類抗生素基因位于該整合子,可能是轉(zhuǎn)座子的一部分,與Tn402密切相關(guān)。

Ⅳ類整合子是在霍亂弧菌基因組中首次發(fā)現(xiàn),其整合酶IntI4與前三類整合子的整合酶有45%～50%的同源性。此類整合子的可變區(qū)可帶有上百個(gè)基因盒,故又稱為超級(jí)整合子(SI)。SI基因盒中的基因除了與細(xì)菌耐藥有關(guān)外,還與細(xì)菌的代謝和毒力有關(guān)。此外在梅氏弧菌、費(fèi)氏弧菌、擬態(tài)弧菌等細(xì)菌的染色體基因組中也發(fā)現(xiàn)了超級(jí)整合子。

Ⅴ類整合子見(jiàn)于最小弧菌。Ⅵ類整合子見(jiàn)于麥?zhǔn)匣【?含有26個(gè)獨(dú)立基因盒[9]。

2 基因盒

2.1 基因盒的結(jié)構(gòu)與種類

2.1.1 基因盒的結(jié)構(gòu) 基因盒是一種可移動(dòng)性基因元件,可以環(huán)狀的形式獨(dú)立存在,也可整合入整合子中而成為整合子結(jié)構(gòu)的一部分。基因盒具有共同的結(jié)構(gòu),由單一基因和一個(gè)位于其下游的整合位點(diǎn)attC(常用59 be表示)組成。attC位點(diǎn)是一個(gè)不完全的反向重復(fù)序列,并含有一個(gè)可被整合酶識(shí)別的特異性整合位點(diǎn)。59 be的長(zhǎng)度為57～141 bp,其最高度保守的特征是兩個(gè)7 bp的核心位點(diǎn):一是核心位點(diǎn)G TT RRRY(R:嘌呤,Y:嘧啶),位于 59 be的3′端;二是與之相對(duì)稱的反向核心位點(diǎn)RYYYAAC,位于 59 be的 5′端。在整合過(guò)程中,重組交換發(fā)生在59 be重組位點(diǎn)的3′端7 bp核心位點(diǎn)保守的Ga37中,59 be的特殊結(jié)構(gòu)基因盒的插入和表達(dá)提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.1.2 基因盒的種類 目前發(fā)現(xiàn)已有80多種基因盒,新的基因盒還在被不斷發(fā)現(xiàn)?；蚝泻笑?內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、頭孢類、甲氧芐啶、氯霉素、磺胺類等抗生素耐藥基因,常見(jiàn)的包括以下幾類:(1)aad、aac基因家族 主要表現(xiàn)對(duì)氨基糖苷抗生素的耐藥。aad基因編碼氨基糖苷腺苷?；D(zhuǎn)移酶,分為A、B兩類。目前發(fā)現(xiàn)aadA有aadA1-aadA7不同的成員,如aad A5編碼對(duì)鏈霉素、壯觀霉素的耐藥性,aadB編碼對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素的耐藥性;aac基因編碼氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶 ,目前有 aac(1)、aac(2′)、aac(3)、aac(6′)。其中aac(3)又可分為aac(3)-Ia、aac(3)-Ib、aac(3)-Ic。(2)dfr基因家族 編碼二氫葉酸還原酶(dfr),對(duì)甲氧芐啶耐藥,據(jù)編碼的酶類型不同分為A、B兩類,dfrA編碼的二氫葉酸還原酶有157～187個(gè)殘基,dfrB編碼的酶長(zhǎng)度大約只有78個(gè)殘基[10]。(3)β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因 耐氨芐西林基因盒blaPSE-1,頭孢菌素耐藥基因盒balCMY-2,及 blaVEB-1、blaGES-2、blaCTX-M22 等,還有一種新的OXA-類β-內(nèi)酰胺酶基因盒,特指blaOXA-129基因(由命名中主在http://w w w.lahey.org/S tudies/獲得)[11],越來(lái)越多的此類基因盒被發(fā)現(xiàn)。(4)Ⅱ類內(nèi)含子 它被發(fā)現(xiàn)能夠插入到aadA1基因盒59 be的整合酶結(jié)合的主要區(qū)域1L,Ⅱ類內(nèi)含子[11]的插入方向與基因盒插入的方向相反,它是一個(gè)有424個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的開放讀碼框(ORFII),其序列與逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)。(5)其他基因 大多有甲氨嘧啶類、氯霉素、鏈霉素、紅霉素、氨基糖苷酰苷、乙?；D(zhuǎn)移酶耐藥基因,它們抗性基因分別是 sut1、qucE、cmlA 和 catB3、blap1 、sat 、ere 和 orf5等[12-13]。此外還包括chrA 、orfF,orf1、qacE_1。

2.2 基因盒的表達(dá) 基因盒只有在整合子中才能轉(zhuǎn)錄,現(xiàn)已知的絕大多數(shù)基因盒不含啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄需從整合子的啟動(dòng)子開始。基因盒的表達(dá)水平不僅依賴于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱,而且與離啟動(dòng)子的距離有關(guān)(距離啟動(dòng)子越近的基因盒表達(dá)率越高),在質(zhì)粒上的整合子還與質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)[4]。

基因盒總是以 5′-3′的方向整合入整合子,使其可以在上游啟動(dòng)子Pant的作用下得以表達(dá)?？股啬退幍木_度取決于上游基因盒的數(shù)目和性質(zhì)。被捕獲的基因盒5′端與整合酶的att I結(jié)合,3′端59 be片段與attC發(fā)生特異性整合。同時(shí)整合酶也可介導(dǎo)attC和att I以外的第二位點(diǎn)的整合,稱為非特異性整合。雖然整合頻率較低,但因其周圍只有一個(gè)重組位點(diǎn)而不能被切除,其在細(xì)菌基因組、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子進(jìn)化中起重要作用。整合酶介導(dǎo)的基因盒的剪切主要發(fā)生在兩個(gè)attC位點(diǎn)之間。59 be?？尚纬梢环N莖環(huán)結(jié)構(gòu),可抑制下游基因盒的表達(dá)。但下游表達(dá)較弱或不表達(dá)的基因盒在抗生素的壓力下,有可能借助整合酶介導(dǎo)的基因重組,插入到強(qiáng)啟動(dòng)子或靠近Pant的位置,由低水平表達(dá)轉(zhuǎn)為高效表達(dá),耐藥水平隨之上升。

2.3 基因盒的移動(dòng) 一個(gè)整合子可以捕獲一個(gè)或多個(gè)基因盒,且同一個(gè)基因盒可以整合到不同的整合子上,從而導(dǎo)致基因盒的移動(dòng)。整合子介導(dǎo)的基因盒的移動(dòng)被稱作盒捕捉,其發(fā)生過(guò)程有兩種機(jī)制。第1種:整合酶從整合子(供體)中切除的一個(gè)基因盒,形成一個(gè)共價(jià)閉環(huán),然后它插入到另一整合子(受體)的attC位點(diǎn);第2種:整合酶重組的供體和受體質(zhì)粒,這些質(zhì)粒都是由att I或者attC位點(diǎn)所形成的單一的共聯(lián)體質(zhì)粒,它們可由整合酶分成兩個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒,一個(gè)質(zhì)粒(受體)通過(guò)盒捕捉獲得基因盒,另一質(zhì)粒則失去。這兩種機(jī)制都是保守過(guò)程,它們所形成的最后的盒捕捉產(chǎn)物通過(guò)序列測(cè)定是沒(méi)有區(qū)別的[3]。

3 整合子-基因盒的檢測(cè)

目前整合子的檢測(cè)主要運(yùn)用分子生物學(xué)的方法。由于第1、2、3類整合子與細(xì)菌耐藥密切相關(guān),臨床菌株中整合子的檢測(cè)主要針對(duì)此三類整合子。

3.1 PCR檢測(cè)法 目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法,根據(jù)Ⅰ類整合子兩端保守序列及耐藥基因序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)整合子和基因盒,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。也可用熒光定量PCR進(jìn)行整合酶基因的快速檢測(cè)。

3.2 核酸雜交法 根據(jù)Ⅰ類整合子兩端保守序列設(shè)計(jì)探針,對(duì)質(zhì)粒和染色體DNA進(jìn)行核酸雜交檢測(cè)整合子,此外可利用基因盒探針檢測(cè)其中基因盒的種類。

3.3 其他檢測(cè)方法 Hardw ickb S A等[14]建立了一種SYBR實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢測(cè)自然環(huán)境中細(xì)菌的整合子,還可以用基因芯片技術(shù)對(duì)整合子及基因盒進(jìn)行檢測(cè)和分析。

4 整合子-基因盒系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥性關(guān)系

細(xì)菌的耐藥性甚至是多重耐藥性開始大量出現(xiàn),致使抗生素的療效逐漸下降,給臨床治療帶來(lái)了極大的困難。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)整合子的研究呈積極狀態(tài),Centron D等[15]研究了多重耐藥的粘質(zhì)沙雷菌,發(fā)現(xiàn)在同一60 kb的質(zhì)粒上存在3個(gè)整合子。第2個(gè)整合子上發(fā)現(xiàn)了新的氨基苷類耐藥基因ant(3′)-Ii-aac(6′)-Ⅱd,兼具 ant(3′)-I和 aac(6′)-Ⅱ的功能。隨后又出現(xiàn)一個(gè)不完整的 blaOXA-10基因,這是一種新的基因融合形式。第3個(gè)整合子上有3個(gè)已知的基因盒,它們都存在于Ⅱ類內(nèi)含子上,此種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)賦予該菌明顯的多重耐藥性。Grape M等[16]報(bào)道105株尿液標(biāo)本中分離的革蘭陰性細(xì)菌中59株(56.2%)整合子陽(yáng)性,整合子陽(yáng)性菌株平均對(duì)4.2種藥物耐藥,而整合子陰性菌株平均僅對(duì)1.9種藥物耐藥。Shi L等[17]報(bào)道46株分離自臨床標(biāo)本的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中第一類整合子的陽(yáng)性率為100%,表明第一類整合子也廣泛分布于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中。有研究分析過(guò)20株鮑曼不動(dòng)桿菌,其中有1株帶有Ⅰ類和Ⅱ類的雜交整合子,說(shuō)明了整合子新的進(jìn)化方向。在抗生素選擇性壓力下,整合子會(huì)不斷進(jìn)化,產(chǎn)生新的耐藥形式;整合子的存在方式和傳播方式的靈活性為細(xì)菌多重耐藥性傳播加速性提供了便利條件。

5 結(jié)語(yǔ)

研究整合子-基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)和傳播細(xì)菌耐藥性及對(duì)細(xì)菌基因組的進(jìn)化的影響,為闡明細(xì)菌耐藥性的分子機(jī)制提供了新思路。目前研究發(fā)現(xiàn)破壞耐藥基因就可使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感性。隨著整合子的深入研究,許多方面還有待于進(jìn)一步探討:(1)整合子中基因盒的起源。(2)各類整合子出現(xiàn)頻率不同的原因。(3)快速、簡(jiǎn)便、低廉的整合子檢測(cè)方法等。

[1] 徐文.整合子系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥關(guān)系的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,27(1):79-81.

[2] 魏取好,蔣曉飛,呂元.細(xì)菌整合子研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志,2008,33(1):1-5.

[3] Julia E S S hearer,Anne O Summers.In tracellular Steady-S tate Concentration of Integron Recombination Products Varies with Integrase Level and Grow th Phase[J].J M ol Biol,2009,386:316-331.

[4] 魏述永,吳鄧紅,劉世東.細(xì)菌基因盒-整合子系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(1):53-56.

[5] 何兆敏,黎旭宇,鄧樹軒.整合子耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30(3):10-11.

[6] 馬艷紅,祁偉.革蘭陽(yáng)性細(xì)菌整合子的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),2009,30(3):131-134.

[7] 郭宇,張正.整合子基因盒系統(tǒng)與銅綠假單胞菌多重耐藥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,12(8):1069-1072.

[8] 周強(qiáng),柏彩英,鄧晨暉,等.臨床分離多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌Ⅰ類整合子檢測(cè)及耐藥性研究[J].廣東醫(yī)學(xué),2009,30(7):1105-1106.

[9] 蔣宏,劉繼芬.整合子-基因盒系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥研究進(jìn)展[J].四川省衛(wèi)生管理干部學(xué)院學(xué)報(bào),2008,27(2):122-125.

[10]蘭全學(xué),劉衡川.整合子-基因盒系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防學(xué),2006,33(5):725-729.

[11]Geovana Brenner Michael,Marisa Cardoso,Stefan Schw arz.Molecular analysis of multiresistant porcine Salmonella enterica su bsp.enterica serovar Bredeney isolates from S outhern Brazil:identification of resistance genes,integrons and a g rou p II in tron[J].J International Journal of A ntimicrobial Agen ts,2008,32:120-129.

[12]Gui-Qin Wan g,Cong-Ming Wu.Characterization of integronsmediated antimicrobial resistance among Escherichia coli strains isolated from b ovine m astitis[J].J Veterinary Microbiology,2008,127:73-78.

[13]Liming Lua,Lei Daia,Yang Wang,et al.Characterization of antimicrobial resistan ce and integrons among Escherichia coliisolated from animal farm s in Eastern China[J].J Jou rnal homepage,2009,1-6.

[14]Hardw ick S A,Stokes H W,Findlay S,eta l.Quantification of class1 in tegron abundance in naturalenvironments using real-time quantitative PCR[J].J FEM S Microbiol Lett,2008,278(2):207-212.

[15]Centron D,Roy P H.Presen ce of a groupⅡintron in a m ultiresistantSerratia m arcescen s strain that harbo rs three integrons and a novel gene fu sion[J].Antimicrob Agen ts Chemother,2002,46(5):1402-1409.

[16]Grape M,Farra A,K ron vall G,etal.Integrons and gene casset tes in clinical isolates of co-t rim oxazo le-resistant Gramnegative bacteria[J].J Clin MicrobiolInfect,2005,11(3):185-192.

[17]Shi L,Zh engM P,Xiao Z H,et al.Unnoticed sp read of class 1 integrons in Gram-positive clinical strains isolated in Guangzhou,China[J].J MicrobiolImmu nol,2006,50(6):463-467.