尹煒?lè)?綜述 楊 歡 審校 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,長(zhǎng)沙 410011)

外泌體是由活細(xì)胞分泌的直徑為60～90 nm的囊狀小體,在電鏡下為脂質(zhì)雙層膜包圍的扁平球體,呈特征性的杯狀外型,存在于血清、尿液、唾液、乳汁等體液中[1]。作為一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),它能代表其來(lái)源細(xì)胞行使一系列生物學(xué)功能,如腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體能介導(dǎo)免疫逃逸,腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體參與了口服耐受作用的發(fā)揮,胎盤(pán)絨毛膜上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體能介導(dǎo)母胎耐受等等。近年來(lái),樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)來(lái)源的外泌體(Dex)引起了人們廣泛的關(guān)注,因其即能誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤,抗弓形蟲(chóng)等病原體的強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,又能在一定條件下誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受,在介導(dǎo)抗腫瘤免疫、移植免疫耐受方面顯示了巨大的應(yīng)用前景。近年來(lái)其在自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用也逐漸引起關(guān)注,本文就Dex疫苗的研究現(xiàn)狀以及Dex在自身免疫性疾病的臨床應(yīng)用作一簡(jiǎn)要綜述。

1 Dex疫苗的研究現(xiàn)狀

1.1 Dex疫苗的體內(nèi)作用機(jī)制 應(yīng)用熒光示蹤,可以發(fā)現(xiàn)Dex在體內(nèi)的遷移途徑。將髓源Dex真皮內(nèi)或皮下注射入小鼠體內(nèi),在注射部位Dex即能被位于皮膚的未成熟DC捕獲,其表面表達(dá)的分子被未成熟DC吸收,24小時(shí)后DC和Dex復(fù)合物則遷移至相應(yīng)的引流淋巴結(jié)區(qū),引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答或者誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受[2]。

目前Dex在體內(nèi)具體的作用機(jī)制尚不清楚,研究發(fā)現(xiàn),Dex疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫效應(yīng)與Dex表面分子和機(jī)體的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。成熟樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源外泌體(mature dendritic cell derived exosome,mDex)表面高表達(dá)MHC Ⅱ 、CD40、CD80、CD86共刺激分子,在相應(yīng)的淋巴結(jié)引流區(qū),mDex能與DC和T細(xì)胞相互作用,使初始T細(xì)胞活化為抗原特異性T細(xì)胞,誘導(dǎo)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。而非成熟樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體(immature dendritic cell derived exosome,imDex)表面低表達(dá) MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86 共刺激分子,在與引流區(qū)淋巴結(jié)T細(xì)胞相互作用時(shí)不能活化T細(xì)胞,導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能或低能反應(yīng),從而誘導(dǎo)免疫耐受。在小鼠心臟移植的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),預(yù)先用imDex處理受者,移植手術(shù)后受者體內(nèi)CD4+細(xì)胞顯著減少,且移植物中浸潤(rùn)的白細(xì)胞減少,IFN-gama mRNA的表達(dá)明顯下降[3]。應(yīng)用基因工程技術(shù)使樹(shù)突狀細(xì)胞表面表達(dá)FasL、IL-4、IL-10等分子來(lái)源的外泌體(即 Dex-FasL、Dex-IL-4、Dex-IL-10)能啟動(dòng) T 細(xì)胞內(nèi)的免疫抑制信號(hào),誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生免疫耐受效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),Dex-IL-4、Dex-IL-10和 Dex-FasL表面表達(dá)較高濃度的FasL,它們利用Fas/FasL途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生免疫耐受效應(yīng)[2,4,5]。機(jī)體的內(nèi)環(huán)境主要指的是DC的成熟狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)DC的成熟狀態(tài)對(duì)于Dex疫苗效應(yīng)的發(fā)揮起重要作用。在無(wú)DC或未成熟DC存在的條件下,mDex或imDex均不能有效激活T細(xì)胞,而應(yīng)用促DC成熟因子(LPS、TNF-α、CpG、CD40L)后,mDex或 imDex在體內(nèi)能不同程度的激活T細(xì)胞[6]。

1.2 Dex疫苗的應(yīng)用途徑 研究證明,通過(guò)真皮內(nèi)注射的Dex能刺激引流淋巴結(jié)區(qū)3.8%的淋巴細(xì)胞增殖,而皮下注射的Dex僅能引起 0.9%的淋巴細(xì)胞增殖,表明通過(guò)真皮內(nèi)注射的 Dex能夠影響的淋巴細(xì)胞數(shù)是皮下注射的4倍[7]。因此,我們不難推斷,要想在免疫增強(qiáng)或者免疫耐受中取得較大效果,應(yīng)該采用真皮內(nèi)注射,而非皮下注射的方式。然而,上述兩種途徑與靜脈注射的途徑相比,哪種更能影響淋巴細(xì)胞尚無(wú)報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

1.3 Dex疫苗的特點(diǎn) mDex疫苗已經(jīng)應(yīng)用于治療黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的1期臨床試驗(yàn),顯示了巨大的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的DC疫苗相比,Dex疫苗安全穩(wěn)定具有以下優(yōu)點(diǎn):①非細(xì)胞性,可以冷凍儲(chǔ)藏,在冰凍狀態(tài)下儲(chǔ)存幾個(gè)月,活性不會(huì)受影響。②Dex疫苗注入體內(nèi)后其表面分子不會(huì)像DC那樣經(jīng)歷表型變化,而且其在體內(nèi)發(fā)揮作用不受CTL細(xì)胞的影響[8]。③Dex疫苗的副作用輕微且可耐受。在進(jìn)展性非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)中,9名Ⅲ～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者在實(shí)驗(yàn)前接受了Dex介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的觀察。研究發(fā)現(xiàn),3名患者48小時(shí)后的皮膚測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性。其中,2名患者有5 mm的硬結(jié)和紅斑,1名患者有6 mm的硬結(jié)和紅斑。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的副反應(yīng)觀察發(fā)現(xiàn)8名患者有注射部位的紅斑、硬結(jié)和腫脹。1名患者有流感樣癥狀,1名患者有手臂的外周性水腫[9]。④Dex疫苗具有抗原特異性。利用exosome display技術(shù)將可溶性抗原負(fù)載至Dex上,可以產(chǎn)生抗原特異性 Dex[10]。該種Dex用于小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答或免疫抑制效應(yīng)。

1.4 Dex疫苗在抗腫瘤治療的應(yīng)用 鑒于負(fù)載腫瘤抗原肽的Dex在體內(nèi)能引發(fā)CD4+或CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性的免疫應(yīng)答以及能夠按照GMP標(biāo)準(zhǔn)成功地制備人單核細(xì)胞源DC來(lái)源的Dex。目前Dex在抗腫瘤方面應(yīng)用的研究廣泛開(kāi)展。在惡性程度極高的黑色素瘤的治療中,給15例表達(dá)MAGE2的黑色素瘤患者每周四次的皮下或者靜脈注射冰凍保存的負(fù)載MAGE2抗原肽的Dex,連續(xù)使用四周,劑量逐步增加,對(duì)于病情穩(wěn)定者和腫瘤消退者再每3周注射一次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)間接負(fù)載處理的Dex使1例患者病情得到穩(wěn)定,并接受了后續(xù)的每3周注射1次,共8次的治療,患者病情得到了長(zhǎng)期控制。間接負(fù)載處理的Dex使1例患者皮下腫瘤消退,但是發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移[11]。在Ⅲ、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌即進(jìn)展性非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)中,入組的病人有9例,在為期兩年的隨訪觀察中2例病人的病情穩(wěn)定時(shí)間超過(guò)了12個(gè)月[9]。上述研究使我們看到了Dex在臨床抗腫瘤治療中的巨大應(yīng)用前景,然而要想讓Dex疫苗發(fā)揮更好的抗腫瘤效果,Dex的結(jié)構(gòu)、體內(nèi)應(yīng)用的方式方法以及最適劑量方面有待進(jìn)一步研究。

1.5 Dex在移植免疫耐受方面的應(yīng)用 髓源imDex和調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源外泌體(regulatory dendritic cell derived exosomes,rDex)均能夠誘導(dǎo)宿主的移植免疫耐受。Pêche等[12,13]先后證實(shí)了在小鼠心臟移植手術(shù)中,髓源imDex能調(diào)節(jié)受者的抗移植免疫反應(yīng),并能顯著延長(zhǎng)同種異體心臟的存活時(shí)間。劉袁媛等[14]在小鼠皮膚移植試驗(yàn)中觀察到 rDex比 imDex能產(chǎn)生更好的移植免疫耐受效應(yīng)。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)預(yù)示著Dex將會(huì)是抗移植排斥反應(yīng)的新方法。

2 Dex在自身免疫性疾病治療中的應(yīng)用

目前,Dex在自身免疫性疾病治療方面的應(yīng)用主要是在對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的觀察上。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。實(shí)驗(yàn)觀察所應(yīng)用的研究模型為遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型。研究發(fā)現(xiàn),imDex以及通過(guò)基因工程技術(shù)使髓源DC表面表達(dá)IL-4、IL-10、FasL來(lái)源的Dex均能產(chǎn)生抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用。盡管其具體作用機(jī)制尚不十分明確,但是上述實(shí)驗(yàn)研究能夠?yàn)閷⒁种菩訢ex用于其它自身免疫性疾病治療的研究奠定了基礎(chǔ)。

過(guò)表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4融合蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 immunoglobulin,CTLA-4Ig)的髓源DC來(lái)源的外泌體(IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex),能夠抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的炎癥進(jìn)展,阻止類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展。IDO是近來(lái)研究較多的一種免疫調(diào)節(jié)蛋白,能夠維持外周耐受,在妊娠、腫瘤、自身免疫性疾病和移植耐受方面起著重要作用。IDO能降低T細(xì)胞中色氨酸的含量,利用產(chǎn)生細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物,即犬尿氨酸,影響T細(xì)胞的活性。CTLA-4Ig是 IDO的誘導(dǎo)物,通過(guò)DC表面B7分子能誘導(dǎo)DC表達(dá)IDO。研究發(fā)現(xiàn),IDO/Dex本身并不含有 IDO蛋白,它們能產(chǎn)生免疫耐受的可能機(jī)制是傳遞功能性的IDO蛋白給DC或者T細(xì)胞[15]。

2.1 體外預(yù)實(shí)驗(yàn) 首先,通過(guò)基因工程技術(shù)使表面表達(dá)細(xì)胞因子IL-10的髓源DC分泌外泌體,即重組IL-10(r-IL-10)處理過(guò)的或含IL-10重組腺病毒載體感染(v-IL-10)的骨髓來(lái)源的Dex(r-IL-10/Dex和v-IL-10/Dex),在將其應(yīng)用于于小鼠體內(nèi)試驗(yàn)之前先檢驗(yàn)了其是否具備抑制T細(xì)胞活性的功能。將vIL-10/Dex、未轉(zhuǎn)染 IL-10的普通髓源 Dex和 rIL-10/Dex分別加入混合淋巴細(xì)胞液中,5天后觀察其中的T細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),vIL-10/DC能完全抑制T細(xì)胞增殖,未轉(zhuǎn)染IL-10的普通髓源DC的抑制作用很少或者基本沒(méi)有,而rIL-10/Dex具有中等的抑制效果[4]。該實(shí)驗(yàn)不僅證實(shí)了IL-10/Dex的免疫抑制效應(yīng),而且比較了三種Dex的免疫抑制效應(yīng),顯示了通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的IL-10/Dex的免疫抑制效應(yīng)更強(qiáng),為IL-10/Dex及其他抑制性Dex的體內(nèi)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.2 體內(nèi)試驗(yàn)的應(yīng)用 在小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中,分別比較vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的能力。分別將vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理鹽水注入小鼠一側(cè)的后足墊真皮內(nèi),對(duì)側(cè)注入等劑量的生理鹽水,分別在24、48和72小時(shí)后觀察雙側(cè)足的腫脹情況,并用宏觀評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行記錄。結(jié)果顯示和生理鹽水組相比vIL-10/DC組注射足的足墊腫脹情況減輕了大于50%,對(duì)側(cè)腫脹情況減輕了40%。vIL-10/Dex組雙側(cè)足墊腫脹情況減輕了65%。在膠原性關(guān)節(jié)炎的模型中,在小鼠被抗原免疫后的第28天,靜脈注射vIL-10/Dex和等劑量的生理鹽水對(duì)照,結(jié)果注射vIL-10/Dex組不僅膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生日期推遲了,疾病的嚴(yán)重程度亦降低了。而生理鹽水組的膠原性關(guān)節(jié)炎則按往常一樣進(jìn)展。同樣的,將通過(guò)基因工程技術(shù)使表面表達(dá)IL-4或FasL的髓源DC來(lái)源的Dex,即IL-4/Dex或FasL/Dex,真皮內(nèi)注入小鼠一側(cè)后足墊,亦能減輕小鼠足關(guān)節(jié)的遲發(fā)型超敏反應(yīng),當(dāng)靜脈注射上述Dex時(shí)能夠推遲膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生時(shí)間以及減弱其炎癥反應(yīng)的程度。盡管Dex誘導(dǎo)免疫耐受的具體作用機(jī)制尚不明確,但是Kim[2]對(duì) Dex進(jìn)行熒光標(biāo)記示蹤發(fā)現(xiàn),在注入真皮內(nèi)的48小時(shí)后,在真皮中能檢測(cè)到Dex和CD11c+細(xì)胞的復(fù)合物,在同側(cè)窩的淋巴結(jié)引流區(qū)該復(fù)合物亦被檢測(cè)到,而在對(duì)側(cè)淋巴結(jié)引流區(qū)、肝臟和脾臟中則未被發(fā)現(xiàn)。這似乎不能解釋對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)的免疫抑制現(xiàn)象。對(duì)于靜脈注射的Dex而言,24小時(shí)后檢測(cè)到Dex在肝臟中被F4/80-(大部分為CD11c+)細(xì)胞所捕獲,在脾臟中則被F4/80+脾巨噬細(xì)胞所捕獲。將用IL-4/Dex致耐受的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中的CD11c+分離出來(lái),在將其注入同基因系的被抗原致敏的小鼠體內(nèi),亦能減輕遲發(fā)型超敏反應(yīng)的炎癥程度。這不禁使我們聯(lián)想到,Dex在真皮內(nèi)注入后,和同側(cè)淋巴結(jié)區(qū)的CD11c+細(xì)胞作用將自身所攜帶的致免疫耐受分子傳遞給CD11c+,由CD11C+行使抑制抗原特異性免疫耐受的作用。而靜脈注射的Dex則循環(huán)至肝脾區(qū),被F4/80+脾巨噬細(xì)胞和肝臟 F4/80-細(xì)胞捕獲,傳遞免疫抑制性分子后,由F4/80+脾巨噬細(xì)胞和肝臟F4/80-細(xì)胞行使免疫抑制功能。進(jìn)一步的致免疫耐受機(jī)制尚不清楚,有待于進(jìn)一步研究。

2.3 Dex免疫抑制效應(yīng)發(fā)揮的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題 要想發(fā)揮Dex的免疫抑制功能,并將其成功地應(yīng)用于自身免疫性疾病的動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn),有幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題不容忽視。

2.3.1 外泌體的完整性 外泌體膜是否完整對(duì)于其免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。Kim等[2]發(fā)現(xiàn)在小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型中,經(jīng)過(guò)四輪的冰凍-解凍處理后的髓源Dex/vIL-10或Dex/rIL-10不再具備抑制關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的作用,電鏡觀察到經(jīng)過(guò)四輪的冰凍-解凍后,Dex表面雙層膜不再完整,并且在Dex碎片中Hsc70已經(jīng)檢測(cè)不到了,而已知的Hsc70是體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受的重要分子。同樣的,通過(guò)聲裂解處理的Dex表面膜裂解,亦不能發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)。

2.3.2 免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮所依耐的分子 Dex免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮與其表面分子相關(guān)。首先,供者Dex必須和受者來(lái)源于同一基因型,Dex免疫效應(yīng)的發(fā)揮具有MHC依賴(lài)性。其次,給Dex負(fù)載一定抗原肽產(chǎn)生的免疫耐受效應(yīng)是針對(duì)特定抗原,對(duì)其它抗原則不起作用。另外,根據(jù)前述,IL-4/Dex、IL-10/Dex和FasL/Dex能夠產(chǎn)生對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥抑制作用與其表面表達(dá)FasL有關(guān)。在IDO試驗(yàn)中,IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex作為媒介傳遞功能性的IDO蛋白,其抑制效應(yīng)的發(fā)揮必須有B7分子的參與。

3 問(wèn)題與展望

Dex在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的應(yīng)用研究提示,Dex在抗腫瘤免疫和誘導(dǎo)移植耐受有巨大應(yīng)用前景。然而,對(duì)于Dex的具體體內(nèi)作用機(jī)制,以及作為亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物性疫苗,如何使其功能發(fā)揮最大的作用以及如何最大限度降低其副作用仍需要進(jìn)一步研究。

近年來(lái),Dex在治療自身免疫性疾病的研究陸續(xù)開(kāi)展,在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中,我們看到了IL-4/Dex、IL-10/Dex、FasL/Dex、IDO/Dex 和 CTLA-4Ig/Dex對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的抑制作用,這為我們將抑制性Dex應(yīng)用于自身免疫性疾病奠定了基礎(chǔ)。然而各種Dex的具體作用機(jī)制尚未完全明了,需要進(jìn)一步研究。為將Dex應(yīng)用于臨床,我們必須找到一種免疫抑制效應(yīng)最強(qiáng)的Dex,故我們尚須比較等劑量的上述四種Dex和imDex或者其它抑制性Dex免疫抑制效應(yīng)的程度、起效時(shí)間和作用持續(xù)時(shí)間等方面有無(wú)差異。另外,Dex的免疫效應(yīng)的發(fā)揮與其劑量是否有關(guān)、是呈何種關(guān)系以及如何調(diào)控其劑量以取得最大的免疫抑制效亦尚須進(jìn)一步研究。

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