劉光澤，周 笛，范 沛，顧為望

(1.解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602;2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 501515)

研究報告

人鼠肝組織嵌合體模型的制備

劉光澤1，周 笛2，范 沛2，顧為望2

(1.解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602;2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 501515)

目的研究制備人鼠肝組織嵌合小鼠模型。方法將人骨髓干細胞直接注射到一定日齡胎鼠肝組織，每只注射移植約1×109人骨髓干細胞。用免疫組化對出生一定日齡移植小鼠肝臟進行甲胎蛋白免疫組織化學(xué)檢測，檢定分析人肝細胞在小鼠體內(nèi)嵌合生長情況。結(jié)果移植人骨髓干細胞胎鼠出生2月齡、12月齡可檢測到甲胎蛋白。結(jié)論將人骨髓干細胞移植小鼠肝臟內(nèi)能夠存活并分化成人肝細胞并能夠長期存活。

人鼠嵌合;甲胎蛋白

病毒性肝炎是嚴重危害人類健康的傳染性疾病，長久以來一直面臨缺少穩(wěn)定可靠的感染細胞模型和動物模型此大難題，阻礙了對HBV、HCV致病機制、抗病毒藥物篩選和疫苗研究等的研究進程。近年來隨著新的生物技術(shù)的迅速發(fā)展，小鼠肝臟嵌合人肝細胞將為人類針對人體肝臟疾病和肝細胞病毒的研究提供絕佳的體內(nèi)模型［1］。我們以KM小鼠作為受體，通過肝臟對胎鼠移植人骨髓干細胞，使人的骨髓干細胞誘導(dǎo)胎鼠產(chǎn)生免疫耐受可在小鼠肝臟內(nèi)長期存活，使人的骨髓干細胞在小鼠肝臟內(nèi)增殖，探討建立一種制備人肝組織的嵌合體動物模型可能性，從而制備丙型病毒肝炎感染模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

KM小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，由中心SPF實驗室飼養(yǎng)，合格證號為2008A071;孕期13～15 d雌性鼠為實驗對象。Percoll細胞分離液購自美國Pharmacia公司、兔抗人AFP多克隆抗體購自Invitrogen，編號:18-0055。

1.2 人骨髓干細胞的移植

1.2.1 人骨髓干細胞的獲取:取臨床無血液疾病志愿者髖骨內(nèi)骨髓，密度梯度離心法分離與貼壁法分離人BMSCs。用血球計數(shù)板計數(shù)并計算細胞存活率，臺盼藍擔(dān)染法計算干細胞存活率，超過80%用于實驗，所得人骨髓干細胞的一般達109。獲取的人骨髓干細胞立刻進行胎鼠肝內(nèi)移植。

1.2.2 胎鼠肝內(nèi)移植:先后選八只孕期為13～15 d的KM小鼠戊巴比妥鈉肌注麻醉，沿小鼠腹白線逐層剪開，暴露子宮，此時肉眼可見子宮內(nèi)胎鼠，因胎鼠皮膚未發(fā)育完全故較透明，可清晰看到腹腔內(nèi)顏色較深部位，即為肝區(qū)。用棉棒輕輕操作，用微量進樣器將預(yù)先備好的人骨髓干細胞逐個注入胎鼠肝臟內(nèi)，每只的量為5 μL，并用醫(yī)用棉簽按壓注射點止血，注射完畢后，將胎鼠輕輕送回腹腔復(fù)位，縫合創(chuàng)口。自注射后開始觀察。

1.3 標本采集

對于小鼠進行活體肝臟標本采集.具體方法:先將小鼠麻醉，通過手術(shù)打開腹腔，暴露肝組織并切取小部分小鼠肝臟組織，創(chuàng)面迅速灼燒止血。肝組織固定制備成臘塊備用。

1.4 檢測

免疫組化甲型胎兒蛋白(AFP)簡稱甲胎蛋白的檢測。按照試劑盒操作說明，采用S-P法染色對小鼠體內(nèi)人肝細胞的甲胎蛋白進行特異性測定，以人肝組織表達AFP為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，有AFP的存在。結(jié)果肝組織中陽性細胞的AFP主要位于肝細胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。用免疫組化對移植人骨髓干細胞處理獲得的2月齡實驗鼠肝組織人特異AFP檢測，結(jié)果鼠肝組織可見有散在AFP陽性肝細胞，主要位于肝細胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，表明有AFP表達;到12月齡再次活體取肝組織進行肝組織AFP檢測，鼠肝組織仍可見到AFP陽性肝細胞，這表明嵌合的人肝細胞可在鼠肝臟長期存在(圖1，見彩插Ⅵ)。

2.2 鼠肝內(nèi)移植結(jié)果

本實驗共注射8只孕期為13～16 d KM孕鼠，其中只有3只孕鼠成功產(chǎn)仔，分別產(chǎn)2只、4只和4只共計10只仔鼠，移植成功率為37.5%。其他實驗孕鼠注射后第2日或第3日流產(chǎn)，這主要是由于通過子宮直接對胎鼠注射易造成較大損傷引起孕鼠流產(chǎn)而失敗。

3 討論

胚胎時期肝細胞并未成熟，AFP合成量很高，白蛋白合成量較低，仍處于幼稚狀態(tài)，與成人肝細胞存在很大差異［2］。既往研究發(fā)現(xiàn)移植的肝細胞能和宿主肝實質(zhì)一體化［3］，然而在正常的受體肝臟，移植肝細胞只能顯示出有限的數(shù)量增長活性［4］。過去有關(guān)研究一般選用人肝細胞、胎肝細胞。幾年來干細胞能在正常肝臟內(nèi)增殖［5］并具有很強的增生性，還可分化成肝細胞［6］，是肝細胞移植理想的細胞之一，所以本研究選用骨髓干細胞為供體細胞。

對新生小鼠移植人骨髓干細胞或肝細胞的方法建立人鼠嵌合小鼠，是當前肝病研究的一個重要方向。如果動物在胚胎發(fā)育時期接觸到外來抗原，它們會逐漸對這些抗原產(chǎn)生耐受，允許異種移植物在體內(nèi)中存活［7］。對嚙齒類動物的研究結(jié)果表明，制備理想的“嵌合肝”就要從選擇人的何種細胞為供體、何種動物為受體及二者相互作用等因素來研究。即一方面降低宿主對移植細胞的免疫排斥和宿主對移植細胞增殖的抑制;另一方面移植細胞有更強的生長優(yōu)勢，為此我們研究對胚胎期胎鼠移植干細胞。人肝細胞移植到小鼠后重構(gòu)小鼠肝臟對于分析代謝性或病毒性肝病的基因治療和探討生物機制大有裨益［8，9］。

AFP是人體胚胎時期胎兒肝細胞和卵黃囊內(nèi)合成的一種糖蛋白，胎兒出生1～2周后迅速下降至成人水平(0～20 μg/L)。AFP的生成量和胎兒肝臟或肝細胞再生時的分裂細胞數(shù)量呈正相關(guān)，故有人認為AFP是由分裂增殖的肝細胞所產(chǎn)生，也可用于了解肝細胞再生情況［10，11］。本實驗結(jié)果顯示實驗鼠在2月齡和12月齡進行人肝組織特異AFP免疫組織化學(xué)檢測，均可見有陽性細胞，證實了小鼠體內(nèi)嵌合有人肝細胞存在，且表明我們制備的人鼠“嵌合肝”實驗鼠，嵌合鼠肝組織人的細胞具有人肝細胞特性。本實驗證明了可以利用人骨髓干細胞來制備人鼠“嵌合肝”，并這種“嵌合肝”可持續(xù)至少12個月時間。

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The Preliminary Investigation of Human-mouse Liver Chimeric Model Preparation

LIU Guang-ze1，ZHOU Di2，F(xiàn)AN Pei2，GU Wei-wang2
(1.The Liver Disease Centre of PLA，458 th Hospital of PLA，Guangzhou 510602，China; 2.The Institute of Comparative Medicine of South Medical University，Guangzhou 510515，China)

ObjectiveTo establish the human mouse chimeric model of HCV。MethodsThe human bone marrow stem cells were transplanted into each mouse with the number of 1×109via liver to fetal mouse in KM mouse. Testing the AFP in the transplanted mouse liver by immunohistochemistry to analyze the living condition of human liver cell in the mouse body。ResultsAFP was tested after the transplantation of months within its normal value。ConclusionThe human bone marrow stem cells can live and differentiate into the liver cells after transplantation into mouse liver.

Human-mouse chimeric;AFP

R332

A

1671-7856(2010)10-0055-03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.015

2010-06-22

廣東省科技項目(項目編號A060305004)。