黃國(guó)團(tuán) 王麗蘭 蔡豪斌, 秦新民 陽(yáng)艷華 貝鴻池 張 旋

1.桂林英美特生物技術(shù)研究所,廣西 桂林 540001;2.桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541004;3.廣西師范大學(xué),廣西 桂林 541004

C-反應(yīng)蛋白 (CRP)是一種非常重要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,主要由肝臟合成。正常人群的 CRP 濃度很低,新生兒為 0.1～0.6mg/L,成年人為 0.4～5.2mg/L。炎癥、感染和組織損傷等發(fā)生后,CRP 濃度會(huì)迅速升高,病情轉(zhuǎn)好又迅速降低至正常水平,升高的幅度與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[1]。檢測(cè)CRP 對(duì)于許多疾病的篩查、監(jiān)測(cè)與療效評(píng)估具有重要價(jià)值。臨床應(yīng)用中多采用免疫透射比濁法測(cè)定CRP,能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化分析,使用方便快捷。

CRP 受到越來(lái)越多的關(guān)注,獲得CRP 對(duì)于進(jìn)行生產(chǎn)研究具有重要意義。商品 CRP 具有較好的性能,但是價(jià)格昂貴。擬建立一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分離純化人CRP 的方法,獲得高純度的 CRP,并進(jìn)行初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CNBr-activated Sepharose 4B(GE Healthcare),CRP(Leebio),PEG6000(SHBC),CRPMcAb(桂林英美特生物技術(shù)研究所),全自動(dòng)生化分析儀 (日立 7080)。

1.2 方法

1.2.1 CRP 的分離純化

1.2.1.1 硫酸銨沉淀總蛋白

從醫(yī)院收集臨床血清樣本 (CRP＞100mg/L),用 80%飽和度的硫酸銨沉淀總蛋白,4℃沉淀過(guò)夜;于 4℃、8000rpm 離心 30min,用基礎(chǔ)緩沖液 (20mmol/L Tris-HCl,pH 7.8)溶解沉淀,充分透析除去硫酸銨。

1.2.1.2 初步純化CRP

取適量活化好的 DEAE 填料按常規(guī)方法裝柱,用基礎(chǔ)緩沖液平衡。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品上樣,通過(guò)改變離子強(qiáng)度進(jìn)行梯度洗脫 (洗脫液中 NaCl 濃度分別為 80、120、250mmol/L),按 A280收集洗脫液,進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳和 Western Blotting 檢測(cè) 。

1.2.1.3 親和層析精制純化CRP

取 1gCNBr-activated Sepharose 4B 填料用 1mmol/L HCl進(jìn)行溶脹及洗滌,加入 30mg 用偶聯(lián)緩沖液 (100mmol/L NaHCO3,500mmol/L NaCl,pH 8.3)充分透析的 CRP McAb,4℃搖擺偶聯(lián)過(guò)夜;用 1mol/L 的乙醇胺封閉 2h;以緩沖液A(100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 4.0)與緩沖液 B(100mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl,pH 8.0)交替洗滌 3次,裝柱。初步純化的目的蛋白用結(jié)合緩沖液 (20mmol/L Tris-HCl,120mmol/L NaCl,pH 7.8)充分透析后,上樣,以洗脫液 (100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 2.9)洗脫,按 A 280收集洗脫液,進(jìn)行檢測(cè)[2]。

1.2.2 CRP 多克隆抗體的制備純化

選一只成年健康山羊作為免疫動(dòng)物,以自提高純度CRP 為抗原,按常規(guī)方法制備多克隆抗體,采用正辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化,并進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 CRP 免疫透射比濁定量檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

用制備的多克隆抗體建立CRP 免疫透射比濁定量檢測(cè)方法,并進(jìn)行評(píng)價(jià)[3]。采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法,主波長(zhǎng)為 340nm,反應(yīng)溫度為 37℃,S、R1、R 2的進(jìn)樣體積分別為 10、 180、20μL,分析點(diǎn)為 16、31,免疫非線性多點(diǎn)定標(biāo) (測(cè)定均在日立 7080全自動(dòng)生化分析儀上完成)。

2 結(jié)果

2.1 CRP的檢測(cè)結(jié)果

DEAE 離子交換層析初步分離純化除去了大部分雜蛋白,但目的蛋白純度不高;通過(guò)親和層析進(jìn)一步精制純化取得了很好的效果。SDS-PAGE 結(jié)果顯示最終的純化產(chǎn)物中出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為 23000的主帶 (圖 1),凝膠掃描顯示其相對(duì)純度為 93.1%;Western Blotting 結(jié)果顯示其能與 CRP 單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合 (圖 2),證實(shí)為 CRP,且與商品 CRP 有很好的可比性。

2.2 CRP多克隆抗體的檢測(cè)結(jié)果

SDS-PAGE 結(jié)果表明純化后的CRP 多克隆抗體純度高(圖 3);Western Blotting 結(jié)果顯示其能與 CRP 發(fā)生特異性結(jié)合 (圖 4);其總蛋白含量為 36.3mg/mL,ELISA 效價(jià)為1：256000。

2.3 CRP免疫透射比濁定量檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 試劑主要成份的確定

以 40mmol/L,pH 7.5的磷酸鹽 (含 100mmol/L NaCl)為基礎(chǔ)緩沖液,R 1中PEG 6000的最佳濃度為 40g/L;R2中CRP 多克隆抗體的最佳濃度為 10mg/mL。

2.3.2 線性范圍

將高濃度的 CRP 樣本稀釋形成不同濃度的樣本,均重復(fù)測(cè)定 3次。結(jié)果表明 CRP 濃度在 3.1～150.0mg/L 范圍內(nèi)線性良好 (y=0.0013x+0.0038,R2=0.9948)。

2.3.3 檢出限

測(cè)定 CRP 濃度為 0.0mg/L 的樣本,連續(xù)重復(fù)測(cè)定 20次,得出檢出限為 0.4mg/L(DL=K'SD/k,K'=3)。2.3.4 重復(fù)性

取不同濃度的樣本,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)測(cè)定 20次;批間重復(fù)性試驗(yàn)每天測(cè)定 1次,連續(xù) 20 d。批內(nèi)、批間不精密度水平﹤ 5%,表明具有良好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性

將試劑 (R 1、R2)置于 37℃,分別于第 1d、3d、5d、7d 取出用于測(cè)定。5d 內(nèi)不精密水平﹤ 10%,表明具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.6 比對(duì)試驗(yàn)

分別用自制試劑與德國(guó)德賽試劑測(cè)定臨床樣本 (n=40)。其回歸方程為 y=1.0325x+0.6502,R 2=0.9997,經(jīng)t 檢驗(yàn)得P＞0.05,表明兩者具有很好的可比性。

3 討論

從人或動(dòng)物的組織、體液或細(xì)胞中分離純化所獲得的蛋白,與生理狀態(tài)下的蛋白最為接近,研究應(yīng)用價(jià)值比較大。血清中成份比較復(fù)雜,采用單一方法難以取得很好的效果,應(yīng)根據(jù) CRP 性質(zhì)特點(diǎn)綜合運(yùn)用不同方法進(jìn)行分離純化。如果直接采用親和層析進(jìn)行分離純化,洗脫難度大,分離純化效果有限,且會(huì)降低親和層析柱的使用壽命。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用飽和硫酸銨對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理和 DEAE 離子交換層析進(jìn)行初步分離純化,除去了大部分雜蛋白,在此基礎(chǔ)上運(yùn)用制備 CRP 單克隆抗體親和層析柱進(jìn)行精制純化。分離純化獲得高純度的 CRP,與商品CRP 有很好的可比性。成功建立了一種分離純化人CRP 的方法,能夠以較低成本大量獲得高性能的 CRP,有利于進(jìn)行生產(chǎn)研究。

考慮到反應(yīng)的敏感性,試劑成本,技術(shù)要求等因素,免疫透射比濁試劑中多使用多克隆抗體而不是單克隆抗體。運(yùn)用自提高純度的 CRP 為抗原,可持續(xù)大量制備出高質(zhì)量的CRP 多克隆抗體;并初步建立起CRP 免疫透射比濁法,各方面性能指標(biāo)均比較好,為研制 CRP 免疫透射比濁試劑奠定了基礎(chǔ)。

[1]Rosalki SB.C-reactive protein[J].Int J Clin Pract,2001,55(4)：269-270.

[2]馬宏偉,趙衛(wèi)國(guó),潘柏申.親和層析法分離純化人心肌肌鈣蛋白 I[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,22(3)：304-307.

[3]Bence LM,Addie DD,Eckersall PD.An immunoturbidimetric assay for rapid quantitative measurementof feline alpha-1-acid glycoprotein in serum and peritoneal fluid[J].Vet Clin Pathol,2005,34(4)：335-341.