項(xiàng)薔薇 李海靜 羅運(yùn)春 王 強(qiáng) 朱妍艷 李昌崇

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院呼吸科浙江省小兒呼吸疾病診療中心,溫州 315000）

哮喘小鼠肺組織Rho、ROCK信號通路與氣道炎癥及選擇性拮抗劑Y-27632的干預(yù)①

項(xiàng)薔薇 李海靜 羅運(yùn)春②王 強(qiáng) 朱妍艷 李昌崇

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院呼吸科浙江省小兒呼吸疾病診療中心,溫州 315000）

Rho/Rho激酶[又名Rho蛋白相關(guān)卷曲螺旋激酶（Rho-associated coiled-coil formingkinase,ROCK）]信號通路是機(jī)體各組織細(xì)胞普遍存在的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,它伴隨多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子受體后耦聯(lián)機(jī)制而激活,且可能整合于這些炎癥因子的后效應(yīng)中,介導(dǎo)疾病的病理生理過程。國外有研究顯示哮喘動物模型中存在Rho/ROCK信號通路關(guān)鍵分子的異常表達(dá)與活化,可能是導(dǎo)致哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的重要原因[1,2]。故本研究通過制備哮喘小鼠模型,并應(yīng)用ROCKⅡ特異性拮抗劑Y-27632進(jìn)行干預(yù),探討Rho/ROCK信號通路對哮喘小鼠氣道炎癥的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 清潔級雄性BALB/c小鼠39只（訂購40只,運(yùn)輸途中丟失1只）,4～6周齡,體重16～20克（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供）,隨機(jī)分為4組:A組（對照組,n=9）,B組（哮喘模型組,n=10）,C組（地塞米松干預(yù)組,n=10）,D組（Y-27632干預(yù)組）。模型制作參照本學(xué)科方法[3]并稍作改進(jìn):第1和第14天腹腔注射0.1 m l含1%OVA的Al（OH）3凝膠致敏;第25天開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的小鼠噴霧1%OVA,每次30分鐘,連續(xù)定時(shí)激發(fā)1周。對照組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替;Y-27632干預(yù)組于每次激發(fā)前1小時(shí)腹腔注射Y-27632溶液0.1m l（4mg/kg）[4];地塞米松干預(yù)組每次激發(fā)前1小時(shí)按0.5mg/kg腹腔注射地塞米松溶液0.1m l。

1.2 主要試劑 OVA、地塞米松粉劑,購自美國Sigma公司;Al（OH）3自行配制;TNF-α、ELISA 試劑盒

購于深圳晶美生物工程有限公司;山羊抗小鼠ROCKⅡ一抗、免疫組化二抗試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司;Trizol抽提試劑系美國Invitrogen公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司;Y-27632購于美國Biomol公司。

1.3 血、BALF標(biāo)本留取和細(xì)胞計(jì)數(shù) 眼球動脈取血,處死小鼠,作血涂片,余血4℃靜置2小時(shí),2 000 r/mim離心15分鐘,吸取血清分裝保存于-80℃。打開胸腔,暴露肺組織,夾閉左肺門,用PBS緩沖液1ml于氣管插管處注入,反復(fù)抽吸3次,回收率約80%,2 000 r/mim離心15分鐘,取上清液-80℃保存。BALF沉渣用1m lPBS液重懸,取一滴滴于玻片上作沉渣涂片。余液用槍頭抽取100μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)板,低倍鏡計(jì)四角的四大方格中白細(xì)胞總數(shù)。按下式計(jì)算細(xì)胞總數(shù):白細(xì)胞數(shù)/L=（四大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)*109）/20。血涂片及BALF沉渣涂片自然晾干后作瑞氏染色。高倍鏡下對白細(xì)胞作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并計(jì)算嗜酸細(xì)胞百分比。

1.4 肺組織標(biāo)本留取、光鏡制作與觀察 剪切左肺肺門中下肺段,大小約 3mm×3mm×3mm,4%多聚甲醛固定4～6小時(shí),入70%乙醇,送病理科進(jìn)行石蠟包埋。石蠟包埋后制片,切片厚4μm,常規(guī)HE染色,觀察支氣管及血管周圍的炎癥細(xì)胞浸潤情況及氣道粘膜充血等改變。左肺門中上段肺組織迅速置于液氮,-80℃保存,用于檢測mRNA。

1.5 ELISA 法檢測血、BALF中TNF-α濃度 應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Sandwich ELISA）法檢測血、BALF中TNF-α濃度,實(shí)驗(yàn)過程參照試劑說明書進(jìn)行。

1.6 免疫組化SABC法測肺組織中ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá) 按試劑盒操作說明進(jìn)行,一抗工作濃度為1∶200,陽性結(jié)果呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選擇3～5個高倍鏡下支氣管視野（×400）,應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度（Mean optical density,MOD）,計(jì)算10個MOD值的平均值作為該片的MOD值,MOD值越大,蛋白含量越多。

1.7 RT-PCR法測肺組織RhoA、ROCK-ⅡmRNA表達(dá) 按試劑說明書進(jìn)行操作。引物序列RhoA:Sense 5'-3'AGCCTCATGCGGTTAATTTG,Antisense 5'-3'TCTTTGAATTAGCGCCTGGT,長度 247 bp。ROCK ⅡSense 5'-3'GACCTTCCCGATTCCTAA,Antisense 5'-3'TCTCATAGTCGCCTTTC,長度 427 bp。GAPDH:Sense 5'-3'AGTATGACTCCACTCACGGCAA,Antisense 5'-3'TCTCGCTCCTGGAAGATGGT,長度 100 bp。TRIZOL一步法抽提肺組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測定RNA含量。根據(jù)試劑盒說明逐一加入試劑及1μl總 RNA,反應(yīng)總體積 20μl。逆轉(zhuǎn)錄條件:65℃1分鐘→30℃5分鐘→65℃30分鐘→98℃5分鐘→5℃5分鐘。取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系20μl。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3分鐘;94℃30秒變性,54℃（RhoA及GAPDH）或55℃（ROCKⅡ）30秒復(fù)性,72℃1分鐘延伸,共35個循環(huán);后延伸72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳。FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)獲取凝膠圖像,SmartView軟件測定產(chǎn)物光密度值（A值）,用目的條帶產(chǎn)物光密度值與內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增帶的A值之比表示組織中目的基因mRNA的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn),方差不齊者用Dunnett'T3檢驗(yàn),兩變量的相關(guān)采用直線相關(guān)法分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠癥狀比較 在激發(fā)階段,B組小鼠表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等癥狀,嚴(yán)重者呼吸減慢或節(jié)律不齊,動作遲緩或俯伏不動、四肢癱瘓,反應(yīng)遲鈍甚至癱瘓;C、D組也出現(xiàn)上述表現(xiàn),程度較為減輕;A組無上述癥狀。

2.2 各組小鼠細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)和TNF-α濃度細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)結(jié)果:模型組（B組）BALF中細(xì)胞總數(shù)[（4.7±2.83）×109]、BALF及外周血EOS百分比[分別為（8.9±4.38）%,（5.60±2.80）%]均顯著高于正常對照組（A組）[分別為（0.38±0.52）×109,（0.11±0.33）%,0,P＜0.01];C組[分別為（2.4±1.35）×109,（6.15±2.94）%,（3.10±2.23）%]、D組[分別為（3.87±2.95）×109,（5.51±3.86）%,（2.08±1.68）%]顯著低于B組,但高于A組（P＜0.05或P＜0.01）。

ELISA結(jié)果:哮喘組小鼠血清及BALF TNF-α濃度分別為（33.02±19.15）pg/m l,（322.76±112.61）pg/ml,均高于對照組[分別為（4.81±2.08）pg/m l,（94.87±32.51）pg/ml,P＜0.01],BALF中TNF-α濃度C組[分別為（13.00±5.75）pg/ml,（162.74±40.15）pg/ml]、D 組[分別為（22.214±12.616）pg/ml,（212.414±115.952）pg/ml]明顯比B組低 （P＜0.01）,血清含量D組與B組差別無顯著性。

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 哮喘組小鼠肺組織HE染色切片顯示肺內(nèi)支氣管粘膜下、肺內(nèi)支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤（包括EOS、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）,粘膜下水腫,粘液腺增生,管腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出和分泌物,支氣管內(nèi)可見粘液栓,支氣管壁略顯增厚,基底膜輕度增厚且不規(guī)則,細(xì)支氣管平滑肌輕度肥大。對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,各級支氣管腔規(guī)則,粘膜上皮未見脫落,支氣管及血管周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤,細(xì)支氣管平滑肌未出現(xiàn)增殖等情況。Y-27632干預(yù)組及地塞米松干預(yù)組基本相似,炎性細(xì)胞浸潤等病理改變同哮喘組比較明顯減輕,但未完全消失。

2.4 各組小鼠肺組織RhoA、ROCK-Ⅱ表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果:ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)于胞核,主要見于支氣管上皮細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞。ROCK-Ⅱ蛋白免疫組化染色各組均有強(qiáng)陽性表達(dá)。數(shù)值以吸光度（MOD）來表示,哮喘組（0.45±0.05）與對照組（0.33±0.02）比較有顯著性差異（P＜0.01）,地塞米松干預(yù)組（0.37±0.03）及Y-27632干預(yù)組（0.374±0.025）ROCK-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著低于哮喘組（P＜0.05）。

RT-PCR結(jié)果:組織中目的基因mRNA的含量用目的條帶產(chǎn)物光密度值與內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增帶的光密度值之比表示。RhoA、ROCKⅡmRNA表達(dá)呈明顯的一致性:B組 RhoA mRNA（5.01±1.22）及ROCKⅡmRNA（7.45±1.43）均明顯高于A組（分別為3.29±0.74,2.72±0.73）（P＜0.05或P＜0.01）,C組（分別為 4.45±0.80,5.70±0.90）、D組（分別為3.851±0.560,5.06±1.28）介于A組和B組之間（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討論

Rho/ROCK信號通路主要通過調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈的磷酸化,從而在調(diào)控細(xì)胞的動態(tài)改變中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)大鼠氣道高反應(yīng)模型支氣管平滑肌RhoAmRNA表達(dá)的明顯增加,并伴有Rho蛋白水平的上調(diào)與膜轉(zhuǎn)位的增加,而這一系列反應(yīng)均能被Rho拮抗劑C3外毒素所阻斷,提示其可能通過改變支氣管平滑肌的功能而參與哮喘的發(fā)病過程[5,6]。試驗(yàn)證明給卵白蛋白激發(fā)和致敏的小鼠鼻內(nèi)給ROCKⅡ選擇性阻斷劑Y-27632后小鼠BALF液中嗜酸細(xì)胞及炎癥細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性方式減少,且其受體拮抗劑Y-27632能抑制嗜酸性細(xì)胞過氧化物的產(chǎn)生[7-9]。此外,還有報(bào)道顯示Eotaxin誘導(dǎo)的嗜酸細(xì)胞化學(xué)趨化性能被ROCK選擇性阻斷劑Y-27632和Rho抑制劑C3外毒素所抑制,下調(diào)哮喘患者和正常人外周血T細(xì)胞所介導(dǎo)的IFN-γ和lL-2的分泌[10]。證明Rho/ROCK信號通路在炎癥介質(zhì)的生物活性如嗜酸細(xì)胞的生物學(xué)活性、炎癥介質(zhì)的趨化、遷移和粘附過程中活性的調(diào)節(jié)和干預(yù)中均起到重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn),哮喘組小鼠肺組織RhoA及ROCKⅡ的表達(dá)均較對照組明顯升高,氣道上皮細(xì)胞是其主要來源,證實(shí)哮喘小鼠氣道內(nèi)存在Rho/ROCK的表達(dá)異常。哮喘組小鼠癥狀及肺組織病理學(xué)改變明顯,且有明顯的嗜酸細(xì)胞增多,Y-27632干預(yù)組小鼠哮喘組小鼠癥狀及病理學(xué)改變明顯減輕,證實(shí)其有減輕哮喘炎癥的作用。BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量增多,其中EOS占有相當(dāng)比例,并伴隨外周血EOS百分比增高,Y-27632干預(yù)組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和嗜酸細(xì)胞百分比均較哮喘組有明顯下降,證明該通路系通過調(diào)節(jié)嗜酸細(xì)胞的趨化性而參與哮喘的發(fā)病過程。TNF-α是炎癥過程中最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子之一,在啟動哮喘氣道炎癥并使其持續(xù)存在中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠血清及BALF TNF-α的濃度較對照組明顯增高,證明其能介導(dǎo)炎性因子的分泌,Y-27632干預(yù)組小鼠血清及BALF TNF-α的濃度較哮喘組有明顯下降,證明ROCKⅡ特異性受體拮抗劑Y-27632能通過降低炎性因子的分泌從而發(fā)揮抗炎作用。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的最主要藥物,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地塞米松治療組小鼠肺組織 RhoA及ROCKⅡ表達(dá)明顯減少;該組氣道炎癥表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕;BALF和血清中EOS%、TNF-α濃度也較哮喘組有明顯下降,證實(shí)糖皮質(zhì)激素早期干預(yù)可以抑制RhoA、ROCKⅡ的表達(dá),減輕哮喘氣道炎癥。因此抑制RhoA、ROCKⅡ的表達(dá)很有可能是糖皮質(zhì)激素治療哮喘并減輕氣道炎癥的作用機(jī)理之一。

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[收稿2010-04-21 修回2010-08-11]

（編輯 張曉舟）

R562.25

A

1000-484X（2010）12-1124-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.015

①本文為浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y207462）

②通訊作者,E-mail:luoyunchun501@163.com

項(xiàng)薔薇（1980年-）,女,碩士,住院醫(yī)師,主要從事小兒呼吸系統(tǒng)和免疫疾病研究。