魏衍全,田 宏,吳錦艷,尚佑軍,劉湘濤

RNAi實(shí)現(xiàn)方法及在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的應(yīng)用＊

魏衍全,田 宏,吳錦艷,尚佑軍,劉湘濤

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是通過內(nèi)、外源雙鏈RNA觸發(fā)的,由19-23bp小分子干擾RNA片段(siRNA)誘導(dǎo)的同源性m RNA的降解,從而使該基因表達(dá)沉默(gene silence)的過程。它是廣泛存在于動(dòng)、植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默,是生物體在進(jìn)化過程中,抵御病毒感染及因重復(fù)序列和突變引起的基因組不穩(wěn)定性的保護(hù)機(jī)制,同時(shí)也是一種真核生物體內(nèi)的基因調(diào)控機(jī)制。1995年康奈爾大學(xué)的 Guo等〔1〕嘗試用反義 RNA阻斷線蟲par-1基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義RNA和正義RNA都阻斷了基因的表達(dá)。直到1998年Fire等〔2〕在進(jìn)行線蟲基因沉默研究中,分別注射肌肉蛋白的正義、反義和雙鏈 RNA,發(fā)現(xiàn)雙鏈 RNA的抑制效果是單鏈RNA的10到100倍。他們將這種雙鏈RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAi),并因此獲得了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。此后,已陸續(xù)證明在真菌、線蟲、果蠅、植物、動(dòng)物等多種生物中都存在RNAi現(xiàn)象。以下從siRNA如何在細(xì)胞內(nèi)形成來介紹RNAi實(shí)現(xiàn)的方法以及RNAi在免疫相關(guān)基因功能研究中的最新應(yīng)用進(jìn)展。

1 RNAi實(shí)現(xiàn)方法

由于siRNA有效地導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并不像導(dǎo)入其他生物細(xì)胞那么簡(jiǎn)單,因此性質(zhì)穩(wěn)定、作用持久的siRNA的產(chǎn)生及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)功能的方法就成為該項(xiàng)技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。隨著對(duì)RNAi生物機(jī)制研究的不斷深入,為使siRNA最大量地在靶細(xì)胞發(fā)揮作用,最有效地與靶基因結(jié)合,研究者們正在不斷地改進(jìn)各種RNAi實(shí)現(xiàn)方法。目前siRNA細(xì)胞內(nèi)形成大體有以下幾種途經(jīng)。

1.1 理化介導(dǎo)法 是指利用各種物理或化學(xué)方法將siRNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。該方法具有安全、易于大量制備和較高的基因包裹能力等優(yōu)點(diǎn)。目前主要有以下幾種方式導(dǎo)入siRNA:(1)磷酸鈣共沉淀;(2)電穿孔法;(3)DEAE-葡聚糖或多聚季胺鹽(polybrene)法;(4)機(jī)械轉(zhuǎn)運(yùn)法;(5)脂質(zhì)體法;(6)陽離子聚合物介導(dǎo)法等等。Huang等〔3〕設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)針對(duì)戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因的siRNA,通過脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染A 549細(xì)胞來抑制 HEV的感染。結(jié)果顯示,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率很高并且所設(shè)計(jì)的四個(gè)siRNA均能保護(hù)細(xì)胞免受HEV的感染。

1.2 質(zhì)粒DNA載體法 雖然直接轉(zhuǎn)染合成的siRNA能特異性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)同源基因的表達(dá)〔4〕。但是細(xì)胞內(nèi)siRNA很容易被降解,不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的RNAi。相比之下,質(zhì)粒載體就能在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定地生成 siRNA〔5-6〕。通過表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA是研究者為了更有效地利用RNAi而找到的一條新的產(chǎn)生siRNA s的途徑。陸續(xù)有研究嘗試質(zhì)粒DNA載體介導(dǎo)表達(dá),即用質(zhì)粒載體表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成siRNA的前體,克服了將化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的一些缺點(diǎn)。

1.2.1 用 RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)啟動(dòng)子引導(dǎo)的表達(dá)體系 在不產(chǎn)生或存在弱的干擾素反應(yīng)的有機(jī)體或細(xì)胞類型中,可以采用能夠表達(dá) shRNA的質(zhì)粒DNA載體。這種載體用RNA polⅡ作啟動(dòng)子來啟動(dòng) shRNA的表達(dá),后被Dicer裂解為siRNA。這種表達(dá)體系可以有效地沉默靶基因的表達(dá)。

1.2.2 用 RNA聚合酶Ⅲ(RNA polⅢ)啟動(dòng)子引導(dǎo)的表達(dá)體系使用RNA polⅢ啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體表達(dá)體系可以產(chǎn)生siRNA,而不引起明顯的干擾素反應(yīng)。這種表達(dá)體系主要有兩類RNA polⅢ啟動(dòng)子,即U 6啟動(dòng)子與 H1啟動(dòng)子,它們都是 RNA polⅢ啟動(dòng)子家族中的成員。RNA polⅢ識(shí)別4個(gè)以上連續(xù) T堿基的末端終止信號(hào),以便在沒有其他因子作用時(shí)準(zhǔn)確有效地停止轉(zhuǎn)錄。

用RNA polⅢ啟動(dòng)子質(zhì)粒載體來表達(dá)siRNA有兩種方法。一是用不同的串聯(lián)啟動(dòng)子來表達(dá)siRNA的有義和無義鏈。二是表達(dá)shRNA后被Dicer裂解為siRNA。Zhang等〔7〕構(gòu)建了帶有U 6啟動(dòng)子和嵌合體h TERT/U 6啟動(dòng)子的兩種shRNA表達(dá)載體,這兩種啟動(dòng)子的載體分別靶向 EGFP和h TERT基因。構(gòu)建的這四種質(zhì)粒DNA載體分別命名為:shRNA-EGFP-U 6,shRNA-EGFP-h TERT/U6,shRNA-hTERT-U6和shRNA-h TERT-hTERT/U6。結(jié)果顯示,HELF-EGFP細(xì)胞和SMMC-7721-EGFP細(xì)胞 GFP的表達(dá)均能被 shRNA-EGFP-U 6載體表達(dá)的shRNA抑制。無論在體內(nèi)還是體外,h TERT的表達(dá)均能在轉(zhuǎn)染shRNA-h TERT-U 6或shRNA-h TERT-h TERT/U 6的細(xì)胞中被抑制。

1.3 病毒載體法 病毒載體憑借高轉(zhuǎn)染率在基因載體領(lǐng)域中占有重要地位。研究用病毒載體須經(jīng)過改良,去除其病原性的同時(shí)保留其高效的基因轉(zhuǎn)染性。常用的病毒載體包括:腺病毒載體,腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體。

1.3.1 腺病毒載體 腺病毒載體具有載體包裝能力強(qiáng)、細(xì)胞毒性反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn),成為近年來RNAi領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。目前,利用腺病毒載體將siRNA傳遞到組織細(xì)胞內(nèi)以干擾相關(guān)靶基因的表達(dá)已取得了較好的效果。Junn等〔8〕構(gòu)建了可以從一個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼多個(gè)shRNA的腺病毒載體,這些shRNA分別靶向不同的基因位點(diǎn)。結(jié)果顯示,這種表達(dá)多順反子shRNA的腺病毒載體可以沉默相應(yīng)的靶基因的表達(dá),其沉默效率和表達(dá)單一shRNA的腺病毒載體相同。

1.3.2 腺相關(guān)病毒載體 腺相關(guān)病毒載體具有可定點(diǎn)整合,攜帶的外源基因長(zhǎng)期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),并可調(diào)控;感染率高,但無致病性,且免疫反應(yīng)輕微等特性已被廣泛應(yīng)用。Chen等〔9〕通過使用雙鏈伴隨腺病毒-8假模標(biāo)本載體(dsAAV 2/8)來轉(zhuǎn)運(yùn)shRNA到HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)果表明該方法能長(zhǎng)期有效地將該模型肝細(xì)胞中 HBV蛋白、m RNA、復(fù)制型DNA抑制在一個(gè)低量的穩(wěn)定水平。

1.3.3 慢病毒載體 慢病毒載體是一類重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體,由慢病毒經(jīng)過改造而成,具有高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)和宿主范圍廣的特點(diǎn),因此它是真核系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的有力工具。各種慢病毒載體的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制基本相同,主要由三種包含不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒構(gòu)成,分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、包膜糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒。慢病毒載體介導(dǎo)RNAi就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNAi特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合。Stew art等〔10〕于2003年首次報(bào)道使用慢病毒介導(dǎo)RNAi的技術(shù)。他們首先在 HeLa細(xì)胞和原代培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)中表達(dá)外源性綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),然后利用慢病毒載體在這兩種細(xì)胞中表達(dá)針對(duì) GFP的shRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在分裂相細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)和非分裂相細(xì)胞(DC)中,慢病毒介導(dǎo)的RNAi都能特異性抑制 GFP的表達(dá)。此后的研究證明,慢病毒載體能在原代培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞和造血干細(xì)胞等哺乳動(dòng)物各類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定有效的 RNAi〔11-12〕。Deng 等〔13〕基于慢病毒 RNAi系統(tǒng)來表達(dá)針對(duì)乙肝病毒(HBV)基因組的特異性的shRNA,然后將該表達(dá)shRNA的慢病毒載體與HBV質(zhì)粒共注射 HBV復(fù)制小鼠動(dòng)物模型。結(jié)果顯示,在 HBV m RNA和DNA合成水平上,慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)表達(dá)的shRNA均可引起顯著的抑制效果。筆者目前也在利用RNAi技術(shù)開展了病原與宿主細(xì)胞間相互作用的研究,其基礎(chǔ)是建立在慢病毒表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合U 6 Entry Clone載體上,通過制備抗某種病毒的細(xì)胞系,來研究病原與宿主細(xì)胞及病原與抑制靶基因的相互關(guān)系。

2 RNAi在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的進(jìn)展

分子生物學(xué)研究的早期,人們對(duì)基因的了解都是通過基因突變而獲得的。近年來,反向遺傳學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能的研究,使人們對(duì)基因功能的研究取得了飛躍式的發(fā)展,但該技術(shù)在基因重組方面耗時(shí)費(fèi)力。在如今的后基因組時(shí)代,RNAi技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為分析基因功能的又一種方法,得到了廣泛的認(rèn)同。利用RNAi技術(shù)來抑制(或敲低)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中任何基因的表達(dá)開始了反義遺傳學(xué)的革命。Lassus等〔14〕研究結(jié)果證明,RNAi作為一種實(shí)用工具誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默,使得我們以前許多無法運(yùn)用傳統(tǒng)功能基因組學(xué)技術(shù)研究的機(jī)制和模型成為可能,開創(chuàng)了研究基因和蛋白質(zhì)功能的新天地。

2.1 RNAi技術(shù)鑒定基因功能的策略 抑制某個(gè)基因表達(dá)可以為研究者提供該基因功能的有關(guān)信息,這是基因功能研究常用的思路。傳統(tǒng)的基因敲除、反義寡核苷酸和核酶技術(shù)正是運(yùn)用了這一思路。雖然這些方法曾為基因研究甚至疾病的基因治療起到過一定的作用,但最終因其低效、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)而不能得到推廣。自從1998年 Fire等發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以后,研究者們紛紛用dsRNA誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)抑制,很快RNAi以其特異性和高效性抑制特定基因的表達(dá)而成為研究基因功能的強(qiáng)大工具,顯示出明顯優(yōu)于基因敲除和反義核酸技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:RNAi比基因敲除簡(jiǎn)便易行;RNAi容易誘導(dǎo)產(chǎn)生,并且能將目的基因的表達(dá)抑制到極低的水平,甚至完全抑制而優(yōu)于反義核酸技術(shù);RNAi適合進(jìn)行大規(guī)?；蚬δ艿难芯?。

RNAi技術(shù)作為基因功能研究中重要的工具,其原理是:它可針對(duì)某個(gè)已知基因,設(shè)計(jì)出可誘導(dǎo)其沉默的dsRNA,通過合適的手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體,使該基因表達(dá)水平下降或完全沉默,從而了解該基因的功能,這是RNAi技術(shù)在目前最廣泛的應(yīng)用。借助操作簡(jiǎn)便的RNAi技術(shù),可在基因組水平批量地沉默眾多基因,從而實(shí)現(xiàn)大量基因功能的研究鑒定。這些研究已在一些模式生物上成功應(yīng)用,如果蠅〔15〕、線蟲〔16〕、酵母〔17〕等。

2.2 RNAi在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展 1999年 Tuschl等〔18〕報(bào)道在哺乳動(dòng)物中也存在RNAi,只是導(dǎo)入的 RNA是siRNA。2001年Bernstein等〔19〕的研究結(jié)果表明:只有22bp的siRNA才能特異性地阻斷m RNA,同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)體內(nèi)分解dsRNA為siRNA的酶-Dicer。以上研究報(bào)道為RNA i技術(shù)研究免疫相關(guān)基因功能開辟了道路,使人們認(rèn)識(shí)到小于30bp(約19bp-25bp)的 siRNA是哺乳動(dòng)物RNAi賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。siRNA由于片段小,并且可能會(huì)通過模仿Dicer酶的酶切產(chǎn)物而并入到RNA i途徑中,從而避免引起PKR反應(yīng)。

為了更有效地利用RNAi途徑,研究者找到了一條新的產(chǎn)生siRNA的途徑,即構(gòu)建直接表達(dá)長(zhǎng)約21-23 bp小片段siRNA的表達(dá)載體。Sui等構(gòu)建的pBS/U 6載體,可以以載體內(nèi)的DNA序列為模板,直接在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中產(chǎn)生特異的高效的siRNA,成功地抑制了內(nèi)源基因Lamin A/C,Lamin B等的表達(dá)。同樣,B rummelkamp等〔20〕構(gòu)建了p SUPER載體,也可有效抑制內(nèi)源免疫相關(guān)基因CDH-1,cyc-Dl,p53的表達(dá)。Turner小組〔21〕也作了類似的實(shí)驗(yàn),得到了相應(yīng)的抑制結(jié)果。這些結(jié)果表明,RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是可行的,可以用此技術(shù)來鑒定免疫相關(guān)基因的功能。

RNAi作為一種有效、快捷和成本相對(duì)低廉的基因功能研究手段,它可以通過對(duì)免疫相關(guān)基因的關(guān)鍵序列進(jìn)行RNAi來確定該基因的功能。例如,A lvarez A rias DA 等〔22〕利用 RNAi技術(shù)培育了缺失網(wǎng)格蛋白接頭分子(A P-1)的小鼠,在其胸腺細(xì)胞中抑制AP-1的表達(dá),結(jié)果阻礙了未成熟的雙陽性胸腺細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育,導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞完全消失和CD3+CD8+T細(xì)胞嚴(yán)重減少。AP-1缺失在CD4+T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞交互作用中的影響表明,AP-1對(duì)T細(xì)胞的活化和有效免疫突觸的形成至關(guān)重要。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)解釋揭示了AP-1在胸腺細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮功能的可能機(jī)制。Tu siRNA實(shí)驗(yàn)組將體外構(gòu)建的siRNA分別導(dǎo)入大鼠成纖維細(xì)胞和小鼠細(xì)胞,分別抑制了它們的21個(gè)不同類型基因,并重新界定了部分必須基因和非必須基因。Boutros M等〔15〕利用RNAi技術(shù)建立了一個(gè)大規(guī)模研究基因功能的方法,該方法能夠確定果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的所有基因的功能和作用。這是首先用高通量全基因組掃描的方法對(duì)每一個(gè)基因的功能進(jìn)行研究。Zheng L等〔23〕不但應(yīng)用 RNAi研究了細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的作用,還探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們從人類基因文庫中選擇8 000個(gè)靶基因,每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩個(gè)靶序列,應(yīng)用pDual siRNA表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生siRNA表達(dá)框架并構(gòu)建siRNA表達(dá)框文庫,通過它來高通量篩選NFkB信號(hào)途徑中已知的及未知的特有免疫相關(guān)基因。Huo Q等〔24〕利用p Geneclip U 1發(fā)英克隆系統(tǒng)構(gòu)建了針對(duì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2(ERK2)的shRNA表達(dá)載體,然后轉(zhuǎn)染進(jìn) Eca109細(xì)胞系來研究人類食道癌Eca109細(xì)胞中 ERK2的作用。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染進(jìn)shRNA-ERK2載體的 Eca109細(xì)胞與對(duì)照組相比,其生長(zhǎng)受到顯著地抑制。轉(zhuǎn)染后96h的抑制比率為10.45%,ERK2的表達(dá)也與對(duì)照組相比受到顯著地抑制,并且細(xì)胞周期停留在了 G1期。

3 現(xiàn)存問題及展望

雖然RNAi技術(shù)已在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,為研究生物免疫器官分化和生長(zhǎng)發(fā)育過程中基因功能提供了有效方法,但仍有許多亟待解決的問題,如:RNAi作用的確切機(jī)制;siRNA跨膜擴(kuò)散的分子基礎(chǔ);尋找定向?qū)雜iRNA的手段;哺乳類動(dòng)物中的干擾素反應(yīng);脫靶效應(yīng);進(jìn)行RNAi的時(shí)間和靶位點(diǎn)等。所以,今后的研究重點(diǎn)主要集中在RNAi作用的機(jī)制,以及如何進(jìn)一步完善RNAi技術(shù)來研究基因的功能。

筆者現(xiàn)已構(gòu)建了多個(gè)抑制口蹄疫病毒復(fù)制的U6瞬時(shí)載體,在 PK-15細(xì)胞中證明均有抑制口蹄疫病毒復(fù)制的作用。下一步將結(jié)合慢病毒表達(dá)系統(tǒng)建立穩(wěn)定干擾口蹄疫病毒復(fù)制的細(xì)胞系,在細(xì)胞模型水平闡明抑制口蹄疫病毒復(fù)制的靶基因及其相互作用機(jī)理,并為抗病育種打下基礎(chǔ)。可以斷言,RNAi技術(shù)的應(yīng)用前景將是不可估量的,特別是在未來功能基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因育種中將會(huì)起到舉足輕重的作用。隨著RNAi篩選策略的完善,RNAi在基因功能研究中的應(yīng)用會(huì)日趨成熟。

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＊“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006BAD06A 03)資助

劉湘濤,Email:hnxiangtao@hotmail.com

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室 ,農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046

2010-02-15;

2010-06-03