張有為 綜述 陳龍邦 審校

肺癌是世界范圍內發(fā)病率與死亡率均位于第一位的腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占據85%-90%。肺癌的發(fā)生是一個多步驟，多因素參與的復雜的生物學過程，涉及遺傳學（genetic）與表觀遺傳學（epigenetic）信息的改變。DNA甲基化是最重要的一種表觀遺傳修飾方式，高甲基化所致基因轉錄失活，與胚胎發(fā)育和腫瘤疾病有著密切關系[1]。在本世紀初，僅有為數不多的單個抑癌基因（tumor suppressor gene, TSG）甲基化在小規(guī)模NSCLC樣本中的研究，近十年來，越來越多的基因在肺癌中的甲基化狀態(tài)被報道，并且，甲基化的DNA片段也可以在外周血和支氣管上皮脫落細胞中檢測到，某些基因甲基化還與患者不良預后或腫瘤復發(fā)有關，新的高通量高靈敏度的甲基化檢測方法也得到了較快發(fā)展。本文對這方面的進展予以綜述。

1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化，指DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變?yōu)?'甲基胞嘧啶的過程。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但能引起染色質結構、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達[1]。腫瘤組織中DNA常見重復序列、組織特異性基因、印記基因的相關CpG位點往往呈去甲基化狀態(tài)，因此整體甲基化水平比正常組織低20%-60%；但局部區(qū)域如抑癌基因啟動子CpG島卻發(fā)生異常高甲基化，使染色質螺旋程度增加，基因轉錄受到抑制[2]。近來的證據[3]表明，DNA甲基化和組蛋白的化學修飾，如乙?；?、甲基化、泛素化（ubiquitination）、磷酸化、ADP核糖基化（ADP-ribosylation）等存在相互作用，共同調節(jié)基因轉錄。一些研究[4]還表明DNA甲基化直接影響組蛋白的乙?；图谆癄顟B(tài)。

DNA甲基化是一個可逆的過程，高甲基化沉默的基因可以被DNMTs抑制劑如5-氮雜胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-dC）恢復表達，而組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDACs）抑制劑如trichostatin A（TSA）等可顯著增加DNMTs抑制劑的激活效應[5]。

2 NSCLC抑癌基因甲基化概述

最初，NSCLC中甲基化的研究集中于單個或少數功能相對明確的抑癌基因，這些研究的內容包括觀察甲基化在腫瘤組織和正常組織的差異，以及與臨床病理參數的聯(lián)系，進而作為預測或預后指標。如，王銳等[6]發(fā)現，Fibulin3基因在NSCLC組織中的甲基化頻率為43.1%（28/65），在相應正常組織僅為9.2%（6/65），Fibulin3高甲基化導致其mRNA和蛋白水平表達下調，并與腫瘤分化、分期和淋巴結轉移有關；Yu等[7]報道，EPHB6甲基化引起的基因表達下調與遠處轉移風險的增加有關；而Choi等[8]報道，31.6%（31/98）的NSCLC組織檢出ADAMTS1基因甲基化，與患者臨床病理參數如年齡、性別、組織學類型和臨床分期等無相關。通過這些研究，許多抑癌基因在NSCLC中的甲基化狀態(tài)得到鑒定，并且證實DNA甲基化的臨床應用價值，如早期檢測、診斷、化學預防、治療和預后。進一步的研究是聯(lián)合檢測多基因的甲基化狀態(tài)，以明確NSCLC中甲基化頻率較高的位點，作為潛在的生物標記。其中，有些基因得到了較廣泛的關注，在多項獨立研究中均被報道具有較高的甲基化頻率，如APC、CADM1、CDH1、CDH13、p14ARF、p16INK4a、DAPK、FHIT、GSTP1、MGMT、MLH1和RASSF1A等[9]，但也有不一致的結果，解釋有多種，如研究方法、人種以及腫瘤亞型的差異。

Toyooka等[10]研究發(fā)現，甲基化方式的差異不僅存在于NSCLC、小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和類癌之間，在NSCLC的亞型間也存在，APC和CDH13甲基化在腺癌中顯著高于鱗癌，而p16甲基化頻率在鱗癌中高于腺癌。Gu等[11]分析NSCLC中9個基因（p16、CDH1、TIMP3、RASSF1A、FHIT、APC、DAPK、MGMT和GSTP1）的甲基化狀態(tài)，發(fā)現腺癌的甲基化指數（methylation index, MI）顯著高于鱗癌。DNA甲基化方式的差異可能也與某些基因型異常有關，如EGFR突變的腺癌中，p16和CDH13甲基化以及MI均低于野生型；相反，K-ras突變更常見于p16甲基化的組織，K-ras突變的MI也顯著高于野生型[12]。推測甲基化參與EGFR和K-ras介導的肺腺癌發(fā)生過程，遺傳學與表觀遺傳學異常相互作用，共同促進腫瘤發(fā)生。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，一些高通量的檢測方法可以同時檢測更多位點的甲基化。其中的一個方法是對亞硫酸氫鹽處理的DNA進行半定量real time PCR（MethyLight），近來有3篇報道利用MethyLight方法研究NSCLC中27個位點[13]、腺癌中28個位點[14]和鱗癌中42個位點[15]的甲基化狀態(tài)，結果均確定了一組敏感而特異的甲基化標記。Ehrich等[16]利用MALDI-TOF（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight）為基礎的技術，分析96例患者的47個甲基化位點，發(fā)現CLEC3B、MGP、RASSF1、SDK2、SERPINB5和XAGE1A這6個基因的甲基化在癌組織中顯著高于相應正常組織。另一項類似研究[17]分析288個腫瘤相關基因的啟動子區(qū)域，發(fā)現28個潛在的標記性位點，其中5個在肺癌組織中進一步研究的結果確定PAX3和PYCARD/ASC是特異性的高甲基化位點。RLGS（restriction landmark genomic scanning）方法可以分析2 000個啟動子序列，Dai等[18]對1 184個CpG島的研究發(fā)現11個基因在腫瘤組織中有差別的甲基化，其中GNAL和PDX1基因的甲基化比例超過50%。Illumina Golden-Gate platform是一項新的高通量技術，Bibikova等[19]在腺癌中對807個基因的1 505個CpG位點進行分析，發(fā)現一組特異性的甲基化譜，其中的8個（ASCL2、CDH13、HOXA11、HOXA5、NPY、RUNX3、TERT和TP73）進一步經BSP測序法確認。

芯片技術的發(fā)展為DNA甲基化研究提供了更好的平臺，使得甲基化研究不再針對某些特定位點，而能夠在整個基因組水平上無偏倚地分析腫瘤與正常組織或細胞的差異，從而更深入地理解DNA甲基化在NSCLC中的發(fā)生方式，并提供新的標記物。通過基因表達芯片對細胞株以5-Aza-dC處理前后的分析，可以確定DNA甲基化的靶基因，Shames等[20]通過這種方法發(fā)現132個腫瘤特異性的甲基化位點，對其中45個進一步研究，確定7個（ALDH1A3、BNC1、CCNA1、CTSZ、LOX、MSX1和NRCAM）潛在的肺癌標記物。利用MIRA-assisted芯片（methylated CpG island recovery assay coupled with microarray analysis），Rauch等[21]從肺腺癌細胞A549和支氣管上皮細胞NHBE中收集富含CpG區(qū)域的片段，與含有12 192個CpG島的CpG芯片雜交，發(fā)現包括DLEC1、PAX7等基因在內的50個甲基化位點有顯著差異，進一步的研究發(fā)現其中11個位點在鱗癌中的甲基化比例達到80%-100%[22]。

毫無疑問，這些高通量的檢測方法可以迅速地鑒定許多潛在的甲基化標記物，但是采用不同方法報道的甲基化位點又各不相同，彼此之間很少有重復性，因此，這些新的標記物必須通過傳統(tǒng)方法在原發(fā)腫瘤組織中進行驗證，并進行優(yōu)化組合，盡可能地排除人種、性別及腫瘤異質性等因素的影響。

3 游離DNA甲基化與NSCLC早期診斷及篩查

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生中較頻繁的早期事件，可作為NSCLC早期診斷和篩查的潛在標記。大量研究證實，甲基化的DNA片段也可以在外周血和支氣管上皮脫落細胞中檢測到，這種非侵襲性的檢查方法使甲基化檢測有了更好的應用前景。

外周血是比較理想的樣本，腫瘤患者中存在高水平的循環(huán)DNA（circulating DNA），可能源自腫瘤細胞自分泌、裂解、壞死或凋亡等方式的釋放，并往往與原發(fā)腫瘤有著相同的基因改變[23]。NSCLC組織中研究較多的一些甲基化位點幾乎均在血漿/血清中得到了證實。如Hsu等[24]報道，63例肺癌血漿中，BLU、CDH13、FHIT、p16、RARβ和RASSF1A基因甲基化與相應腫瘤組織符合率依次為86%、87%、80%、75%、76%和84%，并且其中任意兩者的甲基化對腫瘤診斷的敏感性和特異性可達73%和82%以上。本研究小組在NSCLC循環(huán)血DNA中篩選NSCLC敏感而特異的甲基化位點，先后發(fā)現p16、DAPK、RASSF1A、SFRP1和KLK10的甲基化比例分別為43.1%（28/65）、30.8%（20/65）、33.8%（27/80）、28.2%（22/78）和38.7%（30/78），與肺部良性疾病及正常對照者差異顯著[25-29]，可作為NSCLC早期診斷的潛在標記。另一項研究[30]表明，NSCLC血漿中p16甲基化聯(lián)合微衛(wèi)星改變（microsatellite alterations）將診斷的敏感性提高到62%，p16甲基化與循環(huán)DNA含量的聯(lián)合，可提高敏感性到80%，優(yōu)于單獨甲基化檢測。因此，循環(huán)DNA甲基化與其它類型腫瘤標記物的聯(lián)合也是提高NSCLC診斷效能的一個研究方向。外周血存在的主要問題有部分樣本DNA含量較低（可望通過提高檢測技術的敏感性來克服）以及缺乏器官特異性。

痰液含有來自肺和下呼吸道的脫落細胞，具有一定的特異性，痰液的甲基化位點也有較多報道。一項研究[31]確定痰液中4個甲基化位點（APC、p16、HS3ST2和RASSF1A）是NSCLC早期檢測的理想組合，AUC為0.8。吸煙人群是肺癌發(fā)病的危險人群，且這部分人痰液較多，不需要誘導即可獲得，因此比較適合早期篩查。Belinsky等[32]報道，肺癌患者痰液中檢測到MGMT、RASSF1A、DAPK和PAX5α中三者及以上的位點甲基化，比非腫瘤吸煙者痰液的幾率高6.2倍。進一步的前瞻性研究表明，在肺癌診斷前18個月收集的痰液樣本中，檢測到p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、PAX5β和GATA5這6個基因中三者及以上的位點甲基化，肺癌風險增加6.5倍[33]。但是痰液主要來自于中央的肺門部位，故可能不適于檢測腺癌，因后者常發(fā)生于肺的邊緣部位。

支氣管灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）是另一個可供選擇的研究樣本，由于支氣管鏡是所有可疑肺癌患者必做的檢查，因此，BAL也較容易獲得，并可能部分含有肺特異性的肺癌細胞或DNA。Kim等[34]對85例NSCLC的BAL研究表明，68%的樣本至少檢出p16、RARβ、H-cadherin和RASSF1A其中之一的甲基化；另一項研究[35]報道，247例可疑肺癌患者（確診89例）的BAL中，聯(lián)合APC、p16和RASSF1甲基化檢測的診斷敏感性為53%，特異性為99%。

4 DNA甲基化與NSCLC預后及復發(fā)

多項研究表明，DNA甲基化與NSCLC臨床分期或淋巴結轉移有關，提示表觀遺傳學異常還參與腫瘤演進，可作為預后判斷的指標。Tang等[36]報道，44%（59/135）的I期NSCLC組織表現出DAPK高甲基化，且5年生存率顯著低于未甲基化的患者（0.46 vs 0.68; P=0.007）。Burbee等[37]報道，30%（32/107）的NSCLC手術標本檢出RASSF1A甲基化，且與患者預后不良有關。Seng等[38]在NSCLC中研究位于染色體3p的5個抑癌基因（RASSF1A 、BLU、RARβ、DLEC1和hMLH1）的甲基化，發(fā)現DLEC1和hMLH1的甲基化比例分別為38.7%和35.7%，二者均與腫瘤分期、淋巴結轉移有關，是不良預后的獨立影響因素。另外一項研究[39]發(fā)現RXRG基因甲基化在吸煙的NSCLC患者中，與預后不良相關，但在吸煙患者中，反而是保護因素。此外，NSCLC中報道較多的預后相關的甲基化位點還有APC、ASC/TMS1、CDH1、CDH13、DAL-1、FHIT、MGMT、p16、RUNX3、CADM1/TSLC1等[40]。值得注意的是全基因組的低甲基化與啟動子區(qū)域的局部高甲基化一樣，也可作為潛在的預后指標，最近的一項研究[41]在379例NSCLC組織中分析APC、CDH13、RASSF1A和LINE-1（long interspersed nuclear element 1，可代表全基因組甲基化水平）甲基化狀態(tài)，發(fā)現LINE-1低甲基化是Ia期NSCLC預后不良的獨立因素。

甲基化與NSCLC復發(fā)的關系也有報道，Brock等[42]對術后40個月內復發(fā)的51例和無復發(fā)的116例I期NSCLC標本，研究p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、CDH13、APC和ASC的甲基化狀態(tài)，結果發(fā)現，p16、CDH13、RASSF1A和APC在腫瘤組織或相應淋巴結（組織學正常）中的甲基化與腫瘤復發(fā)有關，并且不受年齡、性別、種族、手術方式、腫瘤大小、組織學類型及吸煙狀態(tài)的影響；如果p16和CDH13甲基化同時在腫瘤組織和縱隔淋巴結檢測到，復發(fā)的優(yōu)勢比（odds ratio, OR）是15.5。作者認為這些組織學正常的淋巴結中檢測到DNA甲基化提示腫瘤微轉移。

5 DNA甲基化與化療敏感性

近來有研究[43]表明，個別基因的甲基化狀態(tài)與治療反應性有關，如甲基化對DNA修復基因MGMT和hMLH的表觀遺傳學失活，分別與烷化劑和5-FU的敏感性改變有關，對指導膠質瘤和大腸癌的治療具有一定意義；有絲分裂檢驗點（checkpoint）控制基因CHFR的甲基化與微管抑制劑（如VP16）的敏感性有關。因此，可望通過甲基化標記確定不同的腫瘤亞型以利于個體化治療。

14-3-3σ基因是主要的G2/M檢驗點控制基因，Ramírez等[44]在115例經順鉑聯(lián)合吉西他濱治療的進展期NSCLC患者中，研究血清DNA（化療前收集）的14-3-3σ甲基化，結果表明，39例（34%）患者檢出高甲基化，甲基化組中位生存期（15.1個月 vs 9.8個月，P=0.004）和中位進展時間（8 個月 vs 6.3個月，P=0.027）更好，Cox回歸模型證實，只有14-3-3σ甲基化狀態(tài)和ECOG評分（PS）是影響預后的獨立因素。14-3-3σ甲基化可能成為NSCLC鉑類聯(lián)合化療的潛在預測指標。另一項類似研究[45]在吉西他濱（或聯(lián)合其它藥物）一線治療的92例IIIb期和IV期NSCLC患者血清中，檢測APC1A、DAPK、FHIT、p14ARF、p16INK4a、RARβ和RASSF1A的甲基化，盡管沒有一個基因的甲基化與總生存期（overall survival, OS）有關，但在部分緩解（partial response, PR）的病例中，甲基化指數（methylation index, MI）＞0.3的患者生存期更長［中位OS，（36.0±10.3）個月 vs （17.4±4.3 ）個月，HR=0.12，95%CI：0.053-0.54）］，而在穩(wěn)定和進展的病例中，二者無差別。提示一個或多個基因的表觀遺傳學異?？赡茉谌〉门R床緩解的患者中發(fā)揮作用。并且，單一的RASSF1A基因甲基化在這一亞組中，也較未甲基化的患者生存期更長［中位OS，（33.6±10.4 ）個月 vs （12.9±4.7）個月，P=0.0045），多因素分析表明，RASSF1A甲基化可作為PR患者的獨立預后指標。

de Caceres等[46]通過基因表達芯片分析，證實順鉑誘導耐受的NSCLC細胞株中存在IGFBP-3的高甲基化失活，而在順鉑敏感的親本NSCLC細胞株中，siRNA沉默IGFBP-3表達導致細胞對順鉑的耐受；進而，分析36例I/II期NSCLC組織的IGFBP-3甲基化，其中19例順鉑治療無效，17例順鉑敏感，結果發(fā)現，IGFBP-3高甲基化更常見于順鉑耐受組（14/19 vs 2/17, P＜0.001）；并且，在I期病例中，未甲基化的無疾病生存期（disease free survival,DFS）有增加的趨勢。

6 DNA甲基化與NSCLC治療

與基因突變等遺傳學改變不同，DNA甲基化是可以逆轉的過程。因此，在理論上，對癌前病變或腫瘤進行去甲基化處理可以恢復某些關鍵性抑癌基因的功能，從而起到預防和治療腫瘤的作用。目前，表觀遺傳學的治療已經在血液系統(tǒng)腫瘤中取得重大進展，如DNMT抑制劑decitabine（地西他濱）和HDAC抑制劑vorinostat分別被FDA批準用于骨髓異常增生綜合征（myelodysplastic syndrome, MDS）[47]和皮膚T淋巴細胞瘤（cutaneous T-cell lymphoma）[48]的治療。但在多種實體腫瘤中的結果并不令人滿意，原因可能是對這些藥物作用的機制了解不夠，對適宜患者的選擇以及最佳劑量等仍需要進一步探索。在肺癌中的相關研究也剛剛起步，一項由美國國立癌癥研究所支持的I/II期臨床試驗[49]正在Johns Hopkins大學進行，初步結果顯示，Aza-dC聯(lián)合HDAC抑制劑entinostat使部分難治的進展期NSCLC患者獲益，并且耐受性較好。

7 DNA甲基化與microRNA

microRNA（miRNA）是一類長度為20個-24個核苷酸的非編碼小分子RNA，主要通過與靶基因3'端非編碼區(qū)發(fā)生不完全配對，從而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，參與調控個體發(fā)育、細胞凋亡、細胞增殖和分化等生命活動[50]。miRNA的表達失調導致癌基因或抑癌基因異?；罨鸵种剖悄[瘤發(fā)生發(fā)展中的常見事件。研究表明DNA甲基化也是miRNA表達失活的機制之一。在肺癌中報道的兩個位點是miR-34a和miR124a。miR-34家族（miR-34a、miR-34b和miR-34c）是構成p53信號網絡的一部分，miR-34a啟動子區(qū)CpG島甲基化在29.1%（7/24）的肺癌細胞株中檢測到[51]；Gallardo等[52]在70例術后NSCLC標本中檢測miR-34家族的表達和甲基化狀態(tài)，發(fā)現高甲基化引起的miR-34a低表達（P=0.008）與腫瘤復發(fā)有關（P=0.04）。miR124a是CDK6（cyclin D kinase 6）的調控因子，miR124a甲基化在4/6的肺癌細胞系和13/27（48%）的原發(fā)腫瘤中檢測到，而正常肺組織和細胞株均未甲基化，并且，miR124a高甲基化與轉錄失活有關，5-Aza-dC處理使其表達恢復[53]。

另一方面，Fabbri等[54]發(fā)現，miRNA不僅僅是甲基化調控的靶點，反過來也參與對DNA甲基化的調控。DNMT3A和DNMT3B是miR-29s（miR-29a, -29b, -29c）的調控靶點，NSCLC細胞（A549和H1299）中miR-29s過表達導致DNMT3A和-3B表達下降，且NSCLC組織中DNMT3A和DNMT3B mRNA表達與miR-29s水平呈負相關。轉染miR-29a、miR-29b和miR-29c到A549細胞，均導致全基因組甲基化水平的降低，與Dnmt1抑制劑decitabine的效應類似，同時，部分抑癌基因，如FHIT和WWOX啟動子區(qū)高甲基化得以逆轉，表達恢復。

8 結語

隨著人類進入功能基因組時代，在時間和空間上調控基因表達的表觀遺傳學研究受到了廣泛重視。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的主要方式，在肺癌等腫瘤疾病的研究中也有了長足的進展，為腫瘤早期診斷、預后判斷和干預治療提供了新的思路，展現了良好的前景。但仍有許多問題亟待解決，例如，作為腫瘤標記物，目前報道的高頻特異性位點極少，NSCLC中鑒定的大量甲基化位點還需要臨床驗證；甲基化檢測方法眾多，但各自都有一些缺點和局限性，難以普及于臨床；另外，DNMT抑制劑缺乏特異性，可能導致原本處于抑制狀態(tài)的一些基因恢復活性，促進癌變的發(fā)生，具有潛在的副作用。因此，需要繼續(xù)進行DNA甲基化在NSCLC中的深入研究，揭示甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，使其可望在將來成為NSCLC診斷及治療的有效工具。