張 馨, 汪茂榮

內(nèi)毒素(endotoxin)是由革蘭陰性菌所產(chǎn)生、存在于菌體內(nèi)的一類毒素,是菌體細(xì)胞壁的組成成分。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的重要成分,是最經(jīng)典、最初確認(rèn)的致病因子,是迄今為止研究最深入的病原體相關(guān)模式分子(pathogen-associated pattern molecular,PAPM)。內(nèi)毒素有多種生物活性,進(jìn)入人體血液可造成內(nèi)毒素血癥,可引起多種病理生理變化如發(fā)熱、休克、彌散性血管內(nèi)凝血和粒細(xì)胞減少等,可造成嚴(yán)重后果如呼吸窘迫綜合征、急性腎衰竭,甚至多器官功能衰竭等多種疾病,最終可因內(nèi)毒素休克死亡。多年來,關(guān)于LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究顯示,LPS在細(xì)胞外在LPS結(jié)合蛋白(LPS-binding protein,LBP)、CD14、髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)協(xié)助下導(dǎo)致Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,T LR4)受體寡聚化激活,將LPS刺激信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo),通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴和非MyD88依賴的兩條途徑觸發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá),最后啟動炎癥反應(yīng)。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過程中起著極其重要的作用,成為治療內(nèi)毒素血癥研究中的重要靶點。

目前,對內(nèi)毒素血癥尚缺乏特效藥物,一旦炎癥反應(yīng)發(fā)生,要打斷級聯(lián)的病理反應(yīng)過程,就需要采取多位點的藥物治療。復(fù)合藥物的療效明顯優(yōu)于單一藥物的治療,臨床上多采用綜合治療。主要治療手段有：①抗感染、減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收。包括抗生素的使用、LPS合成抑制劑的應(yīng)用、選擇性腸道清潔療法清潔腸道、改善腸道內(nèi)環(huán)境。②清除血液中的內(nèi)毒素。包括血漿凈化技術(shù)、殺菌/通透性增加蛋白、抗菌蛋白、抗菌多肽、鱟抗LPS因子等。③阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或減輕其產(chǎn)生的炎癥效應(yīng)。④加強(qiáng)支持治療,增強(qiáng)機(jī)體對LPS的抵抗力。包括使用免疫調(diào)節(jié)劑和支持治療、抗氧化劑的應(yīng)用、中藥制劑等。目前研究主要集中于對內(nèi)毒素受體、受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及各途徑間的相互關(guān)系上,在此研究基礎(chǔ)上,阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為治療內(nèi)毒素血癥最有效的手段。本文就近年來阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療內(nèi)毒素血癥相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

一、內(nèi)毒素抗體

由于脂質(zhì)A的基本骨架在不同種屬的細(xì)菌間基本一致,因此,利用 LPS的抗原特異性研制抗LPS抗體是抗LPS治療的重要途徑?？筁PS抗體能中和內(nèi)毒素的實驗研究結(jié)果,被認(rèn)為可給內(nèi)毒素血癥的治療帶來新的契機(jī)。特別是當(dāng)抗LPS抗體研制和生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步,由多克隆抗體到單克隆抗體產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化,曾經(jīng)進(jìn)入臨床試驗的有美國研制的鼠源性IgM單抗 E5和人源性的脂質(zhì) A單抗HA-IA。Manthous等[1]曾用 LPS McAbHA-IA治療1例無明確感染灶而出現(xiàn)低血壓休克的暴發(fā)性肝衰竭患者,結(jié)果肝功能改善,病情好轉(zhuǎn)。但抗體存在有菌型抗原的特異性,在后期的臨床試驗中由于其療效未能被證實而自然終止[2]。1993年 Akita等[3]和Warr等[4]報道應(yīng)用LPS免疫產(chǎn)蛋母雞,可以獲得大量類似于單克隆抗體的雞蛋黃抗體IgY。IgY本質(zhì)上是一種IgG,是雞血液中的IgG被選擇性的轉(zhuǎn)移到卵黃中,而且是卵黃中的唯一免疫球蛋白類。IgY對酸、酶、溫度具有較高的穩(wěn)定性,且其被胃蛋白酶消化后所得的Fab′片段穩(wěn)定性和活性更強(qiáng),為通過口服給藥、中和腸道內(nèi)LPS提供了可能。目前,國內(nèi)外抗LPS雞蛋黃IgY抗體的制備和藥理研究仍在進(jìn)行中。

二、LPS受體拮抗劑

(一)E5531[5-8]阻斷內(nèi)毒素產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的最有效的環(huán)節(jié)應(yīng)是阻斷內(nèi)毒素與其受體結(jié)合。在過去的16年中,人們熱衷研究合成多種不同的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)類似物,最終有2代合成類似物進(jìn)入了臨床試驗階段。第一代脂質(zhì)A類似物是E5531,一種在紅英膜細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成的類似物不但本身無毒性,而且可抑制其他革蘭陰性菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子。體外實驗表明,E5531可抑制內(nèi)毒素刺激鼠腹腔巨噬細(xì)胞,人血單核細(xì)胞 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及 IL-10、一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。E5531拮抗內(nèi)毒素作用的機(jī)制在于：E5531能競爭性地與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白 LBP結(jié)合,進(jìn)而抑制內(nèi)毒素與CD14受體及T LR4結(jié)合,從而阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所引起的細(xì)胞活性。2000年E5531進(jìn)入I期臨床試驗,證實E5531可改善內(nèi)毒素引起的頭痛、惡心、發(fā)熱、心動過速、血壓下降等癥狀和體征,降低受試者血中 TNF-α、IL-6、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計數(shù)。后E5531進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗階段,用于LPS引起的發(fā)熱和感染性休克的治療。但研究表明,E5531活性呈時間依賴性降低,可能是由于E5531與血漿脂蛋白相互作用的原因,限制了其臨床應(yīng)用。

(二)E5564[9-14]E5564來源于球形紅螺菌(R phaeroides),被稱為第二代 LPS拮抗劑,其結(jié)構(gòu)、合成較E5531簡單,且比E5531有更高的活性和藥理學(xué)特性。雖然E5564也像E5531一樣會與血漿中脂蛋白結(jié)合而失去活性,但比E5531在血漿中保持活性的能力強(qiáng)。Mullarkey等[11]研究表明,E5564的作用機(jī)制可能是與T LR4/MD-2復(fù)合體結(jié)合后阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),而與血漿中的LBP和可溶性CD14關(guān)系不大。最近,Kim等[10]對TLR4/MD-2與E5564相結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述,更證實了這些分子之間的關(guān)系。在體外實驗,E5564與抗生素聯(lián)用可使小鼠死亡率比單用抗生素減少60%。E5564的安全性和耐受性也在I期臨床試驗中得到了證實。除了偶發(fā)的靜脈炎外,E5564的耐受劑量和時間分別達(dá)到了252 mg和72 h以上。研究表明,與E5531相比,E5564對CK的產(chǎn)生具有更強(qiáng)的抑制作用,且能維持一段時間的高劑量活性,可能對臨床治療更有利。2005年Eisai(日本衛(wèi)材)公司公布了Eritoran(E5564商品名)用于治療嚴(yán)重敗血癥的北美Ⅱ期臨床試驗結(jié)果。與安慰劑組相比,特定劑量的Eritoran組總病死率要低6%。Eritoran研究收入的293例患者,隨機(jī)分為3組：高劑量組(105 mg/d,療程6 d),低劑量組(45 mg/d,療程6 d)及安慰劑組。衛(wèi)材公司指出,該研究的總目標(biāo)是與安慰劑組相比,在28 d時的總病死率至少低5%。根據(jù)PROM(APACHE Ⅱ預(yù)期病死率風(fēng)險)評分,高風(fēng)險亞組死亡獲益最大,其中高劑量組病死率為33.3%,低劑量組為37.9%,安慰劑組為50.9%。與安慰劑相比,高劑量組病死率低 17.6%(P=0.07),低劑量組病死率低13%(P=0.17)。Eritoran的治療膿毒癥Ⅲ期臨床試驗于2006年6月在北美、南美、歐盟等地區(qū)250所單位展開,預(yù)期2009年底能獲得總結(jié)資料。E5564是目前看來的一種具有良好臨床應(yīng)用前景的內(nèi)毒素受體阻斷劑。

(三)CRX-526[15-17]CRX-526是一種化學(xué)合成的脂質(zhì)A類似物,由于其分子中次級脂肪?；溳^短,使其失去了脂質(zhì)A一樣的致炎作用。在2種小鼠結(jié)腸炎的模型中觀察到,無論在體內(nèi)或體外,CRX-526可阻斷LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞促炎因子的生成、釋放。研究顯示,用大劑量CRX-526在LPS刺激前預(yù)處理人單核細(xì)胞,可完全抑制LPS誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。其確切的作用機(jī)制尚在研究中。有一種假設(shè),CRX-526可能是通過直接與TLR4受體復(fù)合物相結(jié)合,從空間上抑制LPS與之結(jié)合。

(四)抗CD14抗體 IC14,一種抗人CD14的嵌合單克隆抗體,研究表明其能明顯減輕LPS的生物效應(yīng),能明顯降低LPS引起的發(fā)熱等臨床癥狀和白細(xì)胞升高,抑制TNF-α、IL-6和 IL-10的產(chǎn)生[18]。I期臨床試驗結(jié)果顯示IC14可減輕LPS誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng),成為阻止嚴(yán)重敗血癥器官衰竭的可行治療手段[19]。此外,該試驗結(jié)果還顯示,無論是健康志愿者或嚴(yán)重敗血癥患者,機(jī)體對IC14具有良好的耐受性,不增加繼發(fā)感染的發(fā)生率。與健康人相比,對于嚴(yán)重敗血癥患者,需要更高劑量的IC14來使mCD14飽和。近期有研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制補(bǔ)體和封閉CD14可有效減輕 LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[20]。抗CD14抗體能使粒細(xì)胞表面的CD14分子飽和,以劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β釋放,但對細(xì)菌無清除作用。同時抑制補(bǔ)體可有效減輕炎癥反應(yīng),但補(bǔ)體的抑制可減少對細(xì)菌的清除,故要聯(lián)合抗生素的應(yīng)用,協(xié)同發(fā)揮作用[21]。

(五)抗T LR4抗體[22-24]T LR4蛋白被認(rèn)為是內(nèi)毒素激活炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵節(jié)點,控制T LR4受體的過度活化,可有效抑制其引起的過激炎癥反應(yīng)。封閉TLR4的作用可能很大程度上阻斷LPS向胞內(nèi)傳導(dǎo)信號,從而阻斷LPS的一系列胞內(nèi)下游反應(yīng)。T LR4基因敲除小鼠表現(xiàn)出對LPS的低反應(yīng)性,LPS不能誘導(dǎo)致死性打擊。體外觀察發(fā)現(xiàn),抗T LR4抗體可抑制 LPS誘導(dǎo)的核因子-κ B(NF-κ B)活化及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。目前,已有抗T LR4抗體在細(xì)胞、動物模型等試驗水平獲得較滿意的結(jié)果。臨床上應(yīng)用尚有待進(jìn)一步的研究。

三、LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾分子

這一類因子不能稱之為LPS受體拮抗劑,但它們在TLR4細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無論上游還是下游過程中,均拮抗LPS誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾分子包括人工合成肽和有機(jī)分子。

(一)TAK-242--環(huán)己烯衍生物[25-28]2005年,日本Takeda化學(xué)實驗室應(yīng)用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞,從其產(chǎn)物中篩選可以抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的小分子物質(zhì),發(fā)現(xiàn)了一種編號5a的前導(dǎo)化合物有此作用,據(jù)此設(shè)計合成了一系列含氨磺?；王ヮ惢鶊F(tuán)的環(huán)己烯衍生物。在抑制炎癥介質(zhì)NO產(chǎn)生的實驗中發(fā)現(xiàn)其中TAK-242活性最強(qiáng)。TAK-242在體內(nèi)外均能抑制 LPS介導(dǎo)的 NO、TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。體內(nèi)試驗中,在3 mg/kg劑量下,LPS休克小鼠全部成活。TAK-242幾乎完全抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞、人U937和P31/FUJ細(xì)胞 NO和TNF-α的產(chǎn)生,而具有抗炎作用的IL-8的產(chǎn)生則不受影響。最新的一項研究結(jié)果,TAK-242抑制炎癥介質(zhì)的種類很多,除NO、TNF-α、IL-6外還包括 IL-1β、IL-6、巨噬細(xì)胞抑制蛋白-2、前列腺素等,小鼠在注射LPS前1 h靜脈注射TAK-242,血清內(nèi)上述炎癥介質(zhì)水平降低,LPS休克小鼠的保護(hù)率升高,均呈劑量梯度效應(yīng),當(dāng)劑量達(dá)到1 mg/kg時,保護(hù)率達(dá)100%。研究顯示,即使在 LPS處理2 h后注射TAK-242,也能改善肝、腎功能障礙,降低 LPS的致死率,即使在器官已出現(xiàn)功能障礙之后。這一現(xiàn)象的機(jī)制尚不明確,有可能是由于其分子量小,能快速分布在組織中并緩解炎癥。由于TAK-242能夠有效抑制LPS介導(dǎo)的多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,并且在 LPS攻擊后給藥仍能迅速起效,因而自2005年首次報道以后,很快進(jìn)入臨床試驗階段,Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗在日本、美國、歐洲國家進(jìn)行,然后又迅速在全球范圍內(nèi)展開Ⅲ期臨床試驗。但由于臨床試驗中藥物在人體的有效性和安全性的不確定以及藥物開發(fā)的時間、經(jīng)濟(jì)成本等問題,日本武田制藥公司于2009年2月宣布停止TAK-242的研究。

(二)髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體肽[29-30]髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cell-1,TREM-1)是2000年新發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞等髓樣細(xì)胞表面的激活型受體,能在細(xì)菌或LPS等的刺激下觸發(fā)髓樣細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子,從而在炎癥反應(yīng)的觸發(fā)和放大過程中起重要作用。多形核白細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞的T REM-1表達(dá)可被LPS誘導(dǎo)。在 TREM-1序列基礎(chǔ)上,Gibot等[30]合成了LP17。培養(yǎng)液中添加LP17或IL-10后,LPS刺激后的促炎細(xì)胞因子的生成明顯減少。LP17劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β生成,可抑制 TREM-1導(dǎo)致的NF-κ B活化。此外,在給予大鼠致死劑量 LPS前1 h予LP17預(yù)處理,將呈劑量依賴性阻止大鼠死亡,且對給予LD100 LPS的大鼠4 h后延遲治療仍具有顯著的保護(hù)作用,在其后的 1周內(nèi)未發(fā)生延遲死亡,提示LP17不僅僅延遲始動階段LPS的致死性,還發(fā)揮持續(xù)性的保護(hù)作用。

(三)貝西沙星(besifloxacin)[31-32]貝西沙星是一種新型氟喹諾酮類抗菌藥物,用于眼部感染的局部治療。最近研究結(jié)果提示,貝西沙星顯著抑制LPS誘導(dǎo)的 THP-1單核細(xì)胞細(xì)胞因子生成,這些細(xì)胞因子可分為 2組,一組包括GM-CSF、IL-1β、IL-8、IP-10、MCP-1 、MCP-1α,對于這一組細(xì)胞因子,莫西沙星和貝西沙星具有相當(dāng)?shù)囊种谱饔?另一組包括G-CSF 、IL-1α、IL-1ra、IL-6 、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),貝西沙星較莫西沙星抑制作用強(qiáng),而后者在抑制IL-12p40的生成較前者強(qiáng)。這一抑制作用的潛在機(jī)制尚不明確,有報道莫西沙星抑制單核細(xì)胞和囊性纖維化上皮細(xì)胞的MAP激酶和NF-κ B的活化。

(四)復(fù)合物K[33-34]近來,Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物K,一種人和大鼠腸道細(xì)菌對原人參二醇人參皂苷 Rb1、Rb2和 Rc的代謝產(chǎn)物,能調(diào)節(jié)T LR4介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答。MyD88依賴途徑的TLR2和T LR4介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答均能被復(fù)合物K減弱,它作為糖皮質(zhì)激素受體的激動劑配體發(fā)揮其相關(guān)功能。

四、其他內(nèi)毒素拮抗劑

(一)多黏菌素B(polymyxin B,PMB)[35-36]PMB是從多黏桿菌分離得來的一種陽離子環(huán)十肽,N端連有一個8碳或9碳的飽和脂肪酸。PMB可直接與攜帶陰離子的脂質(zhì)A部分特異性結(jié)合,從而抑制脂質(zhì)A的生物學(xué)活性,導(dǎo)致革蘭陰性菌外膜通透性增加,因此,PMB兼有中和LPS和抗菌的雙重作用。PMB是目前已知的LPS中和能力最強(qiáng)的多肽,往往作為LPS中和試驗的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于其具有明顯的神經(jīng)毒性和腎毒性,臨床使用一直受到限制。人們對PMB的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造,在酶的作用下脫去氮端?；兂刹缓舅醾?cè)鏈的九肽,這種改造消除了PMB的毒性,但也失去了殺菌活性,不過仍然保留了與LPS和LipidA特異性結(jié)合并中和LPS的生物學(xué)活性。

(二)Bac7(1-35)[37-38]Bac7(1-35)是一種人工合成的富含絲胺酸的多肽,來源于牛中性粒細(xì)胞中一種具有抗菌作用的蛋白質(zhì)片段。在體外中和LPS能力與PMB相當(dāng),在10 mmol/L濃度下即能完全抑制內(nèi)毒素的活性,腹腔注射Bac7(1-35)1 mg/kg能顯著降低內(nèi)毒素膿毒癥大鼠的死亡率,與60 mg/kg劑量的PMB作用相當(dāng),顯示出良好的抗LPS活性。

盡管目前的診斷技術(shù)、外科治療手段及新抗生素的研發(fā)都有很大進(jìn)展,嚴(yán)重的革蘭陰性細(xì)菌感染所致敗血癥仍會導(dǎo)致很高的病死率(約30%～50%)。分子和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)研究取得很大的進(jìn)展,包括通路中關(guān)鍵分子的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制,以及人工合成分子阻斷內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為治療內(nèi)毒素血癥的有效手段。

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