鄭惠玲，祝珍珍，安俊輝，楊振宇，邢瑞芳，閆林慧

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100

抗山羊ΔfosB基因表達(dá)產(chǎn)物抗體的制備及應(yīng)用

鄭惠玲，祝珍珍，安俊輝，楊振宇，邢瑞芳，閆林慧

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100

ΔfosB是fosB基因的自然截短型，穩(wěn)定存在于許多組織中，在脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的形成和分化中起到重要作用。ΔFosB蛋白可能與鈣在骨和乳腺中的代謝有關(guān)，并且調(diào)控鈣從骨向乳腺轉(zhuǎn)移的信號通路。將奶山羊的 ΔfosB基因亞克隆到pET32a載體得到pET32a-ΔfosB原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)，純化融合蛋白免疫兔子制備多克隆抗體。ELISA檢測顯示抗體效價達(dá)1∶51 200，Western blotting 結(jié)果顯示制備的抗體能特異性檢測原核表達(dá)的ΔFosB蛋白以及在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的ΔFosB蛋白。進(jìn)一步的組織差異表達(dá)檢測表明ΔFosB在山羊的乳腺、骨髓、腦髓、肌肉、心臟、肝和肺組織中均有表達(dá)。

山羊，ΔFosB，原核表達(dá)，多克隆抗體，組織差異表達(dá)

本課題組采用 RT-PCR方法從山羊的乳腺組織克隆得到了ΔfosB基因[11]，證明了ΔFosB在乳腺中有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建了山羊 ΔfosB的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)純化了ΔFosB蛋白，制備了兔抗羊ΔFosB多克隆抗體，為從蛋白質(zhì)水平研究山羊ΔFosB的功能提供了特異性工具。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶His標(biāo)簽的pET32a(+)載體、E. coli BL21 (DE3)菌株、pMD-ΔfosB質(zhì)粒、pAdTrack-CMV-ΔfosB質(zhì)粒、DH5α菌株、HEK-293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。瓊脂糖購自Biowest公司。T4 DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ以及低蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為TaKaRa公司產(chǎn)品。IPTG購自Inalc公司。DNA marker、預(yù)染蛋白質(zhì)marker Ⅲ、瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒及Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自天根生化科技 (北京) 有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸员本┎┐筇┛?博大泰恒生物技術(shù)集團(tuán)公司。辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗兔IgG以及Anti-β-Actin抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購自美國 Millipore公司。引物合成及測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。DMEM高糖及胎牛血清購自美國 Hyclone公司。Lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)山羊的 ΔfosB基因 cDNA序列 (GenBank Accession No. FJ455501)，設(shè)計1對特異性引物，上游：5′-GGAGGATCCATGTTTCAAGCTTTCCCCGG AG-3′ (下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))；下游：5′-TCC GTCGACTCACTCCGCCAGCGGGCCCG-3′ (下劃線為Sal Ⅰ酶切位點(diǎn))。以pMD-ΔfosB質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min 。將回收的 ΔfosB基因克隆到pMD18-T載體得到pMD-ΔfosB，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測，然后送上海生工生物工程有限公司測序。

將 pMD-ΔfosB質(zhì)粒和 pET32a載體分別用BamH I和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化回收 ΔfosB片段及載體片段，按照摩爾比為 8∶1的比例混合ΔfosB和pET32a載體，用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆進(jìn)行菌液 PCR鑒定，鑒定后的陽性克隆再進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET32a-ΔfosB，并送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 pET32a-ΔfosB的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將質(zhì)粒pET32a-ΔfosB轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株BL21(DE3)，挑取陽性單克隆接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，搖菌至OD600≈0.6時，加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，同時用載有空質(zhì)粒 pET32a的大腸桿菌 BL21(DE3) 和未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒 pET32a-ΔfosB作為空白對照及陰性對照。

收集誘導(dǎo)后重組菌液1 mL，5 000 r/min、4℃離心15 min后PBS重懸，冰上超聲破碎，4℃、5 000 r/min離心10 min，保存上清。包涵體沉淀用PBS洗2次，重懸于 8 mol/L尿素中，4℃放置 2~3 h。4℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清。將獲得的細(xì)胞質(zhì)上清與包涵體上清與 1×SDS上樣緩沖液等體積混合，100℃加熱10 min后進(jìn)行 12% SDS-PAGE電泳。

1.2.3 融合蛋白的純化

裂解后的包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后使用0.25 mol/L KCl染色10 min。切下目的條帶，放入預(yù)冷研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，加入 PBS 4℃過夜。10 000 r/min、4℃離心5 min，收集上清后，與1× SDS上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min后，取10 μL樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測。

1.2.4 多克隆抗體的制備

將1 mL純化后的重組蛋白ΔFosB (約0.6 mg/mL)與弗氏完全佐劑等量混合超聲乳化，皮下多點(diǎn)注射分別免疫 2只大耳白兔，免疫前取血作為陰性血清對照。以后每隔 7天使用重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合的乳化液再次進(jìn)行增強(qiáng)免疫，28 d后心臟采血，37℃靜置12 h分離血清，2 000 r/min離心10 min去除血細(xì)胞，收集血清。

1.2.5 多克隆抗體效價檢測及特異性分析

用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (Indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA) 測定抗體效價。將融合蛋白用包被緩沖液稀釋，取100 μL加入酶標(biāo)板中4℃包被過夜；PBST洗滌3次，使用PBST配制的5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；PBST洗滌3次，加入梯度稀釋的血清在37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，使用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，晾干后加入TMB顯色液顯色，最后用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定抗體效價。

采用Western blotting檢測抗體特異性：融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳后，60 V轉(zhuǎn)印約2 h，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，TBST洗滌3次；使用血清為一抗 (分別按1∶200，1∶500，1∶1 000稀釋)，37℃孵育2 h，TBST洗滌3次；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG作為二抗 (1∶5 000稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次；ECL顯影分析結(jié)果。

1.2.6 用自制抗體檢測HEK-293細(xì)胞內(nèi)外源ΔFosB的表達(dá)

HEK-293細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的條件進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前夜將細(xì)胞均勻接種于六孔培養(yǎng)皿中，次日待細(xì)胞融合度達(dá)90%時，將已構(gòu)建好的pAdTrack-CMV-ΔfosB超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程按照 Lipofectamine 2000 Reagent說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)立了pAdTrack-CMV-ΔfosB轉(zhuǎn)染組以及未轉(zhuǎn)染的空白對照組。

轉(zhuǎn)染36 h后，棄細(xì)胞上清液，胰酶消化后離心收集細(xì)胞。PBS漂洗2遍，加入100 μL預(yù)冷的 RIPA裂解液，冰上放置30 min，期間進(jìn)行振蕩使細(xì)胞充分裂解。4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清。將上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%的脫脂奶粉封閉過夜。用自制的ΔFosB多克隆抗體為一抗，37℃孵育2 h，TBST洗滌3次；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次；ECL顯影分析結(jié)果。

1.2.7 山羊ΔFosB組織差異表達(dá)分析

采集關(guān)中山羊的乳腺、骨髓、腦髓、垂體、肌肉、心臟、肺、胃和腎組織樣，各剪取約0.1 g，液氮中研碎，加入 500 μL RIPA裂解液 (50 mmol/L Tris，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1% Triton X-100。使用前加0.5 mmol/L PMSF)，4℃裂解過夜，4℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清。將上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉過夜；分別用自制的anti-ΔFosB多克隆抗體和anti-β-actin抗體 (1∶500稀釋) 作為一抗，37℃孵育2 h，TBST洗滌 3次；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG作為二抗(1∶5 000稀釋)，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次；ECL顯影分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建的pET32a-ΔfosB原核表達(dá)載體酶切后可見pET32a載體條帶和所插入的ΔfosB條帶 (圖1)。測序結(jié)果顯示，山羊ΔfosB基因成功插入pET32a載體，原核表達(dá)載體pET-ΔfosB構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白ΔFosB的表達(dá)

pET32a-ΔfosB經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的蛋白在55 kDa處出現(xiàn)一條帶，其大小與所推測的融合蛋白相對分子量一致 (35 kDa的ΔFosB和20 kDa的標(biāo)簽蛋白)。根據(jù)SDS-PAGE分析，IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時間為6 h，再增加IPTG濃度和誘導(dǎo)時間并不能提高表達(dá)量。超聲破碎細(xì)菌，分別取上清液和沉淀懸浮液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明：重組蛋白ΔFosB的表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，上清液中融合蛋白的表達(dá)量極其微小 (圖2)。

圖1 原核表達(dá)載體pET32a-ΔfosB的構(gòu)建及鑒定Fig. 1 Construction and identification of prokaryotic expression vector pET32a-ΔfosB. (A) Construction of prokaryotic expression vector pET32a-ΔfosB. (B) Agarose gel analysis for restriction enzyme treatment of pET32a-ΔfosB vector. 1: λDNA/Hind III marker; 2: pET32a-ΔfosB digested with BamH I and Sal I produced the long fragment of pET32a vector and 750 bp ΔfosB gene; 3: pET32a-ΔfosB plasmid.

2.3 重組蛋白的純化

誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE分析后，使用0.25 mol/L KCl染色，切膠純化，SDS-PAGE檢測純化結(jié)果。結(jié)果在55 kDa處顯示一條帶 (圖3)，與預(yù)期目的蛋白大小一致，所獲得的融合蛋白純度較高，可用于抗體制備。

圖2 SDS-PAGE檢測重組蛋白ΔFosB的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant protein ΔFosB. 1: pre-stained protein marker III; 2: precipitate of induced pET32a-ΔfosB /BL21 after sonication; 3: supernatant of induced pET32a-ΔfosB/BL21 after sonication; 4: precipitate of uninduced pET32a-ΔfosB/BL21 after sonication; 5: supernatant of uninduced pET32a-ΔfosB/BL21 after sonication.

圖3 重組蛋白ΔFosB的純化Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant protein ΔFosB. 1: low molecular weight protein marker; 2: pET32a-ΔfosB/BL21, induced; 3,4: purified recombinant ΔFosB.

2.4 多克隆抗體效價檢測和特異性分析

iELISA技術(shù)測定制備的多克隆抗血清效價達(dá)到1∶51 200以上 (圖4)。Western blotting印跡結(jié)果顯示，1∶1 000稀釋的自制兔抗羊ΔFosB血清，能夠檢測到分子量約55 kDa的融合蛋白 (圖5)，說明所制備的兔抗羊ΔFosB抗體對原核表達(dá)的ΔFosB蛋白具有較好的特異性。

2.5 用自制抗體檢測HEK-293細(xì)胞內(nèi)外源ΔFosB的表達(dá)

用pAdTrack-CMV-ΔfosB轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照，用自制的兔抗羊ΔFosB抗體進(jìn)行Western blotting檢測。結(jié)果如圖6所示，過表達(dá)ΔFosB的細(xì)胞有條帶，而空白對照無陽性反應(yīng)，說明制備的抗體對細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 ΔFosB有特異性。

圖4 多克隆抗體效價的測定Fig. 4 iELISA analysis of anti-ΔFosB antibody with recombinant ΔFosB. ELISA plates were coated with recombinant ΔFosB, anti-ΔFosB antibodies were serial diluted and dispensed, pipetted into the wells. HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody was used as second antibody.

圖5 Western blotting檢測多克隆抗體的特異性Fig. 5 Identification of the specificity of ΔFosB polyclonal antibody by Western blotting. 1: pre-stained protein marker; 2: 1:1 000 diluted polyclonal antibodies; 3: 1:500 diluted polyclonal antibody; 4: 1:200 diluted polyclonal antibody.

圖6 用自制抗體檢測ΔFosB在HEK-293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig. 6 Expression of ΔFosB in HEK-293 examined by homemade antibody. 1: HEK-293 cell transfected by pAdTrack-CMV-ΔfosB; 2: blank control.

2.6 山羊ΔFosB組織差異表達(dá)檢測

Western blotting 結(jié)果顯示 ΔFosB在山羊的乳腺、骨髓、腦髓、肌肉、心臟、肝和肺組織中均有表達(dá)，而在垂體、脾臟中沒有表達(dá) (圖7)。

3 討論

圖7 山羊ΔFosB組織差異表達(dá)檢測Fig. 7 Tissue distribution of dairy goat ΔFosB. 1: pre-stained protein marker; 2: breast; 3: brain; 4: hypophysis; 5: marrow; 6: muscle; 7: heart; 8: liver; 9: spleen; 10: lung.

Fos家族是一種典型的早期“即刻基因”，能被多種刺激因子誘導(dǎo)快速瞬時表達(dá)，該家族基因編碼的亮氨酸拉鏈蛋白能與 Jun家族蛋白形成二聚體，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化。ΔFosB作為其穩(wěn)定存在的成員已備受關(guān)注，在小鼠中的研究表明ΔFosB參與藥物成癮過程、控制大腦補(bǔ)償機(jī)制[12-15]以及調(diào)控骨形成和脂肪形成。我們采用 RT-PCR的方法已經(jīng)從山羊的乳腺組織克隆出了 ΔfosB基因，證明了 ΔFosB在乳腺中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究ΔFosB在乳腺鈣代謝中的作用奠定了基礎(chǔ)。

本研究將克隆得到的山羊 ΔfosB基因 CDS區(qū)(Coding sequences) 亞克隆到pET32a載體上，優(yōu)化了載體的表達(dá)條件，分別在25℃、30℃和37℃條件下加入0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和1.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)2 h、4 h、6 h和8 h，得到了最佳的表達(dá)條件：37℃，0.5 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)6 h。在優(yōu)化的條件下，重組蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)，由于難以正確折疊而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集從而形成包涵體[16]，用8 mol/L的尿素裂解包涵體獲得重組蛋白，將其與弗氏佐劑混合給兔子皮下多點(diǎn)注射，免疫5次后得到效價高達(dá)1∶51 200的兔抗羊ΔFosB多克隆抗血清。Western blotting檢測顯示所制備的抗體對于原核表達(dá)的ΔFosB融合蛋白以及HEK-293細(xì)胞中超表達(dá)的ΔFosB蛋白具有特異性反應(yīng)。進(jìn)一步將制備的抗體用于組織差異表達(dá)檢測，用來檢測體內(nèi)ΔFosB的表達(dá)情況，結(jié)果表明ΔFosB在山羊乳腺、骨髓、腦髓、肌肉、心臟、肝和肺多種組織中有表達(dá)，在垂體、脾臟中沒有表達(dá)。

ΔFosB蛋白比 FosB蛋白少了 C末端轉(zhuǎn)活區(qū)(C-terminal transactivation domain 和 TATA-結(jié)合蛋白結(jié)合區(qū) (TATA-binding protein-binding domain)，相比Δ2ΔFosB多了N末端Fos同源區(qū) (N-terminal Fos homology domain，F(xiàn)H)，但是它們都具有亮氨酸拉鏈這個關(guān)鍵功能區(qū)[9]。本研究是以ΔfosB基因CDS區(qū)全序列表達(dá)產(chǎn)物作為抗原制備的抗體，所以理論上也可以和FosB以及Δ2ΔFosB產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但是在最后的組織差異表達(dá)檢測中只雜交出了與ΔFosB大小一致的一條帶，這很可能是因?yàn)镕osB和Δ2ΔFosB不穩(wěn)定，在組織中已經(jīng)降解，或者因?yàn)樵谶@些組織中的表達(dá)量過低，Western blotting檢測不到。

綜上所述，本研究成功制備了兔抗羊ΔFosB多克隆抗體，可用于ΔFosB蛋白的表達(dá)水平檢測及功能研究。

REFERENCES

[1] Dobrzanski P, Noguchi T, Kovary K, et al. Both products of the fosB gene, FosB and its short form, FosB/SF, are transcriptional activators in fibroblasts. Mol Cell Biol, 1991, 11(11): 5470?5478.

[2] Inoue D, Kido S, Matsumoto T. Transcriptional induction of FosB/ΔFosB gene by mechanical stress in osteoblasts. J Biol Chem, 2004, 279(48): 49795–49803.

[3] Nestler EJ, Barrot M, Self DW. ΔFosB: A sustained molecular switch for addiction. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(20): 11042?11046.

[4] Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, et al. Phosphorylation of ΔFosB mediates its stability in vivo. Neuroscience, 2009, 158(2): 369–372.

[5] Kveiborg M, Chiusaroli R, Sims NA, et al. The increased bone mass in deltaFosb transgenic mice is independent of circulating leptin levels. Endocrinology, 2002, 143(11): 4304?4309.

[6] Kveiborg M, Sabatakos G, Chiusaroli R, et al. ΔFosB induces osteosclerosis and decreases adipogenesis by two independent cell-autonomous mechanisms. Mol Cell Biol, 2004, 24(7): 2820?2830.

[7] Sims NA, Sabatakos G, Chen JS, et al. Regulating ΔFosB expression in adult tet-off-ΔFosB transgenic mice alters bone formation and bone mass. Bone, 2002, 30: 32–39.

[8] Sabatakos G, Sims NA, Chen J, et al. Overexpression of ΔFosB transcription factor(s) increases bone formation and inhibits adipogenesis. Nat Med, 2000, 6(9): 985?990.

[9] Ohnishi YN, Sakumi K, Yamazaki K, et al. Antagonistic regulation of Cell-Matrix adhesion by FosB and ΔFosB/Δ2ΔFosB encoded by alternatively spliced forms of fosB transcripts. Mol Biol Cell, 2008, 19(11): 4717?4729.

[10] VanHouten JN. Calcium sensing by the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neopla, 2005, 10(2): 129?139.

[11] Zheng HL, Yuan C, Bao LJ. Cloning and bioinformatics analysis of dairy goat Δfosb cDNA. Acta Agric Boreali-Occidentalis Sin, 2009, 18(5): 12?16.鄭惠玲, 袁超, 包黎娟. 山羊 Δfosb基因 cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 18(5): 12?16.

[12] Werme M, Messer C, Olson L, et al. ΔFosB regulates wheel running. J Neurosci, 2002, 22(18): 8133–8138.

[13] McClung CA, Nestler EJ. Regulation of gene expression and cocaine reward by CREB and ΔFosB. Nat Neurosci, 2003, 6(11): 1208–1215.

[14] Renthal W, Carle TL, Maze I, et al. ΔFosB mediates epigenetic desensitization of the c-fos gene after chronic amphetamine exposure. J Neurosci, 2008, 28(29): 7344–7349.

[15] Renthal W, Nestler EJ. Epigenetic mechanisms in drug addiction. Trends Mol Med, 2008, 14(8): 341–350.

[16] Wang Z, Ma HQ, Zhang W, et al. The progress of inclusion body isolation and chromatographic refolding, purification methods. China Biotechnol, 2009, 29(7): 102?107.王增, 馬會勤, 張文, 等. 包涵體蛋白的分離和色譜法體外復(fù)性純化研究進(jìn)展. 中國生物工程雜志, 2009, 29(7): 102?107.

Preparation and application of goat ΔfosB gene expression product antibody

Huiling Zheng, Zhenzhen Zhu, Junhui An, Zhenyu Yang, Ruifang Xing, and Linhui Yan
College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

ΔfosB, a naturally occurring truncated isform of fosB gene, existed in many tissues stably and played an important role in formation and differentiation of adipocyte and osteoblast. ΔFosB may be related to the metabolism of calcium in bone and mammary gland and regulate the signal pathway of calcium transfer from bone to mammary gland. We first sub-cloned ΔfosB gene of goat into the vector pET32a to construct prokaryotic expression vector pET32a-ΔfosB. Then we induced for ΔfosB gene expression efficiently by IPTG. Finally we immunized the adult rabbits with purified recombinant ΔFosB to prepare rabbit anti-goat ΔFosB polyclonal antibody. iELISA analysis showed the antibody with the titer of 1:51 200, and Western blotting result showed that the antibody could specifically detect the ΔFosB protein expressed in prokaryotic cell and HEK-293 cell, respectively. Further Western blotting assay showed that ΔFosB expressed in various tissues of goat in vivo.

goat, ΔFosB, prokaryotic expression, polyclonal antibody, tissue differential expression

小鼠骨肉瘤基因B (Finkel-Biskis-Jinkins murine osteosarcoma B，fosB) 是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族成員之一，有3種表達(dá)產(chǎn)物：FosB、ΔFosB和Δ2ΔFosB，都是細(xì)胞增殖與分化的重要調(diào)節(jié)因子[1]。fosB基因是一種典型的早期即刻基因，在多種刺激物的作用下瞬時誘導(dǎo)表達(dá)[2]。ΔFosB由于磷酸化作用能夠作為一種分子開關(guān)穩(wěn)定存在[3-4]。研究表明 ΔFosB在小鼠中可能參與脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的形成與分化[5-8]。鈣是骨的重要組成成分，ΔFosB調(diào)控骨的形成及骨密度，故ΔFosB可能與鈣在骨骼中的積累有關(guān)。Yoshinori等[9]建立了表達(dá)各種fosB基因轉(zhuǎn)錄本的突變的小鼠胚胎干細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在只表達(dá) ΔFosB的突變細(xì)胞系中有7種鈣結(jié)合蛋白上調(diào)，1種下調(diào)，同時有3種在乳腺中高表達(dá)的蛋白上調(diào)，1種下調(diào)。在妊娠期的母體中，大量鈣通過一些鈣受體蛋白從骨骼向乳腺轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。通過這些結(jié)果我們推測，ΔFosB在骨骼和乳腺的鈣代謝中起重要作用，它可能參與調(diào)節(jié)鈣從骨向乳腺轉(zhuǎn)運(yùn)的信號通路。

March 30, 2010; Accepted: May 17, 2010

Supported by:Basic Research Fund of Northwest A&F University (No. Z109021002), Research and Development Special Fund for Public Welfare Industry (Agriculture) (No. 3-45).

Huiling Zheng. Tel/Fax: +86-29-87092164; E-mail: Zheng.huiling@yahoo.com

西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) (No. Z109021002)，農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項 (農(nóng)業(yè)) 經(jīng)費(fèi) (No. 3-45) 資助。