胡雪峰，林陳勝，王冰梅，韓萍萍，張彥定

福建師范大學生命科學學院 福建省發(fā)育與神經生物學重點實驗室，福州 350108

組織工程與細胞培養(yǎng)

解離的小鼠牙胚上皮細胞在重聚發(fā)育過程仍維持牙齒發(fā)育基因的表達

胡雪峰，林陳勝，王冰梅，韓萍萍，張彥定

福建師范大學生命科學學院 福建省發(fā)育與神經生物學重點實驗室，福州 350108

為了解牙胚細胞解離重聚過程的細胞形態(tài)和分子機制，將小鼠帽狀期牙胚解離細胞重聚，移植到小鼠腎囊膜下培養(yǎng)，組織切片，HE染色，觀察再生牙齒的形態(tài)發(fā)生過程，并用原位雜交的方法進一步檢測了與牙上皮發(fā)育密切相關的基因在再生牙上皮中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，解離重聚的牙胚細胞在牙齒器官的再生過程重現(xiàn)了正常牙齒的形態(tài)發(fā)生過程；解離的牙上皮細胞在重聚和再生過程中保持Fgf8、Noggin和Shh等牙上皮發(fā)育基因表達。以上結果表明，即便是被解離形成分散狀態(tài)的牙上皮細胞，在與牙胚間充質細胞重新聚合后，仍保持牙向分化的潛能。該結果為理解牙齒再生的機理提供新的實驗數(shù)據，對利用干細胞進行牙齒再生的研究有重要的提示意義。

牙齒再生，細胞重聚，牙上皮，基因表達

Abstract:Generation of bio-engineered teeth by using stem cells will be a major approach for bioengineered implantation.Previous studies have demonstrated that dissociated tooth germ cells are capable of generating a tooth after reaggregationin vitro.However, the cellular and molecular mechanisms underlying this tooth regeneration are not clear. In this study, we dispersed E13.5 molar germ into single cells, immediately reaggregated them into cell pellet, then grafted the reaggregates under mouse kidney capsule for various times of culture. We investigated the morphogenesis and the expression of several developmental genes in dental epithelial cells in reaggregates of tooth germ cells. We found that dissociated tooth germ cells, after reaggregation, recapitulated normal tooth developmental process. In additon, dissociated dental epithelial cells retained the expression ofFgf8,Noggin, andShhduring reaggregation and tooth regeneration processes. Our results demonstrated that, despite of under dissociated status, dental epithelial cells maintained their odontogenic fate after re-aggregation with dental mesenchymal cells. These results provided important information for futurein vitrogeneration of bio-engineered teeth from stem cells.

Keywords:tooth regeneration, reaggregation, dental epithelium, gene expression

在組織工程研究領域中，牙齒再生技術的建立已經成為該領域引人注目的發(fā)展方向[1-6]。有關牙齒再生的研究已有多年的嘗試。將兔子切牙牙胚的上皮和間充質打散后，植入到雞胚的尿蘘絨毛膜上培養(yǎng)，這些分散的細胞可以重新聚集起來，形成發(fā)育良好的牙齒結構[7]。在大鼠中，將打散的牙胚組織植入到皮下，也能得到同樣的結果[8]。在由組織工程支架材料 PLGA (poly-L-lactate-co-glycolate) 或PGA/PLLA (Polyglycolate/poly-L-lacate) 構成的牙型支架中，植入打散豬胚磨牙牙胚或大鼠的磨牙牙胚，均能形成牙齒的結構[6,9-12]。我們的研究工作也證實了，在具有誘導牙齒發(fā)育能力的 E13.5 (E：胚股發(fā)育天數(shù)) 的小鼠牙胚間充質中，盡管已經出現(xiàn)基因表達的不對稱性和明顯的組織形態(tài)結構，但將其打散重聚后仍具有誘導牙齒發(fā)育能力[13]。因此，如果能啟動與誘導牙齒發(fā)育過程有關的基因表達譜和信號通路，細胞可以自發(fā)地聚集并形成特定的牙齒結構。牙齒發(fā)育的這一特性對利用干細胞進行牙齒再生有重要的意義。然而，目前對重聚成牙過程中所發(fā)生的細胞形態(tài)變化以及其分子機制所知甚少。本研究探討了牙胚細胞在重聚成牙中的組織形態(tài)的發(fā)生過程以及牙胚上皮細胞是否維持其牙向分化的潛能。為此，我們檢查了重聚牙齒發(fā)育過程的形態(tài)學變化，并進一步檢測了相關的牙上皮發(fā)育基因的表達。結果證實，即使在解離的狀態(tài)下，牙胚的上皮細胞仍保持其發(fā)育基因的表達和牙向分化的潛能。這一結果對利用干細胞進行組織工程牙齒制備的研究有重要的提示意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

所用小鼠購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，由本實驗室飼養(yǎng)。將12周齡雄性昆明鼠與10周齡雌性昆明鼠合籠交配，每日早晨檢查，以發(fā)現(xiàn)陰道栓之時起記為E0.5。將孕鼠斷頸處死，消毒外腹部后，取不同發(fā)育時期的胚胎，將 E13.5的鼠胚分離下頜置于PBS中，E13.5和E14.5及出生3 d的小鼠頭部置于4%多聚甲醛中，4℃固定24 h后包埋，按常規(guī)組織切片，厚度為10 μm，HE染色。

1.2 方法

1.2.1牙胚組織的體外重聚

如圖1所示，取E13.5的小鼠磨牙牙胚，用0.125%的胰蛋白酶在37℃消化5 min，用窄口長頸玻璃吸管將消化后牙胚反復吹打，直至在顯微鏡下觀察形成單細胞懸液。將單細胞懸液以每 1.0×105～1.5×105個細胞為 1份，分配到幾個無菌EP管中；3 000 r/min室溫下離心3 min，使牙胚細胞重聚形成細胞團塊。吸棄上清，加入0.5 mL細胞培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)1 h。用闊口長頸玻璃吸管將重聚的牙胚小心吸出，滴加到Trowell器官培養(yǎng)皿內覆蓋有微孔濾膜的不銹鋼培養(yǎng)支架上，添加細胞培養(yǎng)液到淹沒重聚牙胚的1/3，將培養(yǎng)皿外槽內加2 mL PBS，37℃、5% CO2培養(yǎng) 16～18 h。

圖1 利用解離的牙胚細胞重聚再生牙齒過程示意圖Fig.1 Schematic diagram showing generation of tooth from dissociated tooth germ cells after reaggregation and grafting under mouse kidney capsule. The mouse tooth germ is isolated from mandible, and dissociated into single cells. Then, the single cell suspension is reaggregated into cell pellets, and grafting under mouse kidney capsule. Tooth is formed 2?3 weeks after transplantation.

1.2.2重聚牙胚的體內移植

用 400 μL麻醉劑進行腹腔注射以麻醉昆明小鼠，切開腰背部皮膚，暴露腎臟后，用顯微外科鑷輕輕挑起腎囊膜，并用鈍頭玻璃針分離腎囊膜與腎臟；將培養(yǎng)的重聚牙胚用窄口長頸玻璃吸管轉移到昆明小鼠腎臟表面，并用鈍頭玻璃針輕輕將其推入分離的腎囊膜下 (以每只裸鼠接受 2～3個移植塊為準)，縫合創(chuàng)口。移植3 d、6 d、8 d和14 d后，將昆明小鼠處死，取移植塊，用4%多聚甲醛固定24 h，在37℃下用脫鈣液脫鈣，然后進行脫水、包埋、組織切片 (切片厚度10 μm)。用HE法對4 d、8 d和14 d的移植塊進行形態(tài)觀察，同時用原位雜交的方法對3 d和6 d的移植塊進行基因表達分析 (圖1)。

1.2.3RNA反義探針制備

用NotI、SmaI、HindIII將帶有Noggin、Fgf8、Shh基因特異性片段的質粒線性化，用膠回收試劑盒純化后，以線性化質粒為模板、T3或T7聚合酶合成反義RNA探針。反應體系為：T7/T3聚合酶1 μL，T7/T3 buffer 1 μL，Dig RNA labeling mix 2 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，DNA模板900 ng，加去RNase水至 20 μL體系。36℃反應2 h，加無水乙醇75 μL，8 mol/L LiCl 1.3 μL，?80℃沉淀 1.5 h 后 15 000 r/min離心15 min，75%乙醇洗滌，50 μL DEPC水溶解。

1.2.4原位雜交

參照Zhang等[14]的實驗方法，取組織塊切片在梯度酒精 (100%、90%、70%、50%、35%) 復水，蛋白酶K (1 μg/mL) 消化1 min，將其乙?；笥锰荻染凭撍?；每片加入110 μL含有探針 (2 ng/μL)的雜交液，60℃雜交反應16 h。雜交后，經5× SSC漂洗 3次，每次 15 min，含50% Formamide的2×SSC漂洗2次，每次15 min，NTE (含有20 mg/mL RNase A 和 1 μL RNase T1) 中酶解 30 min，2× SSC漂洗10 min，0.1× SSC漂洗2次，每次5 min。用含有牛血清白蛋白的 2%封閉液預封閉 1 h，加入200 μL含0.2 μL抗 DiG抗體 2%封閉液，4℃孵育過夜。用NTMT 1 h×8洗去多余探針，最后NTMT(加左旋咪唑至終濃度為2 mmol/L) 室溫過夜。每張切片加400 μL BM Purple 堿性磷酸酶底物，避光放置于4℃顯色，脫水，透明、中性樹脂封片，拍照。

2 結果

2.1 重聚牙胚的發(fā)育再現(xiàn)了正常牙齒發(fā)育的過程

小鼠牙胚發(fā)育到 E14.5時，牙上皮外周的細胞增殖速度比牙蕾中心部位的細胞增殖速度快，因此外周部位的細胞突起深入間充質，并包圍間充質，形成帽狀結構，稱為帽狀期。同時，牙胚間充質細胞迅速增殖凝聚成細胞團狀的牙乳頭 (圖2A)，打散重聚的牙胚牙上皮細胞自發(fā)地與牙間充質細胞分離開來，聚合形成牙上皮組織，然后重新啟動牙齒發(fā)育，移植4 d后的重聚牙胚形態(tài)與E14.5的牙齒形態(tài)相似，其上皮細胞外周增殖快，包圍間充質形成帽子結構，間充質細胞也迅速增殖凝聚形成牙乳頭(圖 2D)。正常小鼠牙胚發(fā)育到 E17.5，牙上皮凹陷更深，其兩邊繼續(xù)生長，形成鐘狀結構，稱為鐘狀期。此時的上皮細胞分化形成外釉上皮、星網層和內釉上皮，其中內釉上皮細胞被拉長成柱狀 (圖2B)；移植8 d后的重聚牙齒形態(tài)與E17.5的牙齒形態(tài)相似，發(fā)育到鐘狀期。其上皮細胞分化形成內外釉細胞和星網層，與牙乳頭相臨的內釉上皮細胞拉長成柱狀(圖 2E)。到了鐘狀晚期，內釉上皮分化形成成釉細胞，分泌牙釉質；靠近內釉上皮的間充質細胞分化成一層柱狀的成牙本質細胞，分泌形成牙本質 (圖2C)。而移植14 d的重聚牙齒最終形成發(fā)育良好的牙齒，可見高柱狀的成釉細胞和成牙本質細胞，能分泌形成牙釉質、牙本質 (圖 2F)。再生牙齒的發(fā)育過程重現(xiàn)了正常牙齒的發(fā)生過程。但是，重聚牙胚的形態(tài)學發(fā)生過程因為需要上皮細胞的重新聚集，與正常牙齒的發(fā)育相比明顯出現(xiàn)發(fā)育的延遲。

2.2 重聚牙胚牙上皮表達Fgf8、Noggin和Shh基因

小鼠的牙胚發(fā)育受上皮-間充質細胞中表達的信號分子的調控，在發(fā)育中的小鼠牙胚中，F(xiàn)gf8、Noggin和Shh都是僅在牙上皮特異表達的標志基因，在牙上皮的分化中起重要作用。在 E13.5的小鼠牙胚中，F(xiàn)gf8、Noggin和Shh在磨牙牙胚的牙上皮表達 (圖 3A?C)，而在間充質中幾乎沒有Fgf8、Noggin和Shh的表達。移植3 d的重聚牙胚細胞發(fā)生了重排，間充質細胞與牙上皮細胞發(fā)生分離，牙上皮細胞自發(fā)地聚合形成牙上皮組織，在牙上皮細胞中仍然維持Fgf8和Noggin的表達 (圖 3D?E)；移植6 d的重聚牙胚上皮組織表達Shh(圖3F)，而在間充質幾乎檢測不到Fgf8、Noggin和Shh的表達(圖3D?F)。顯然，解離的牙胚上皮細胞在重新發(fā)育過程中，仍能保持牙齒發(fā)育基因的表達和牙向分化的潛能。

圖2 正常牙胚和重聚牙胚發(fā)育過程的組織形態(tài)比較觀察Fig.2 Histological comparison between development of the normal tooth and that of the reaggregated tooth germ after kidney transplantation. (A?C) Developmental process of a molar tooth. (A) The cap stage at E14.5. (B) The bell stage at E17.5. (C) The terminal differentiation stage at PN3. (D?F) Developmental process of a reaggregated tooth germ. (D) The cap stage after 4 days kidney capsule culture. (E) The bell stage after 8 days kidney capsule culture. (F) The terminal differentiation stage after 14 days kidney capsule culture. Abbreviation: d, dentin; e, enamel; p, dental pulp; am, ameloblast; de, dental epithelium; dp, dental pappila;od, odontoblast; pn, postnatal; iee, inner enamel epithelium; oee, outer enamel epithelium.

圖3Fgf8、Noggin和Shh在正常和重聚牙胚上皮中的表達Fig.3 Expression ofFgf8,Noggin, andShhin the epithelium of nornal and reaggregated tooth germs. (A?C) The expression of tooth developmental genes in the dental epithelia of the normal molar tooth germ at the bud stage. (A) Expression ofFgf8. (B)Expression ofNoggin. (C) Expression ofShh. (D?F) The expression of tooth developmental genes in the dental epithelia of the reaggregated tooth germ after 3 or 6 days kidney capsule culture. (D) Expression ofFgf8. (E) Expression ofNoggin. (F) Expression ofShh. Abbreviation: de, dental epithelium.

3 討論

牙齒的發(fā)育與其他器官的發(fā)育一樣，上皮組織與間充質之間存在誘導和被誘導的關系。就牙齒發(fā)育而言，作為誘導者，能誘導相鄰組織表達特定基因并指導牙齒發(fā)生的組織，稱該組織具有誘導牙齒發(fā)育的潛能 (Odontogenic potential)。反之，能對具有誘導牙齒發(fā)育潛能的組織的發(fā)育信號起反應，而被誘導進入牙齒發(fā)生過程的組織，我們稱該組織具有牙齒發(fā)育的被誘導潛能 (Odontogenic competence)。只有具有誘導牙齒發(fā)育潛能的組織存在時，牙齒的發(fā)育才能得以進行。經典的實驗胚胎學組織重組實驗證明，誘導牙齒發(fā)育潛能先是位于牙上皮，隨后轉移到牙間充質。在 E11.5天時，將牙上皮與頭面部非牙源性的間充質組織重組后，能發(fā)育形成牙齒的結構。因而，此時牙齒發(fā)育的潛能位于牙上皮中。而到了 E12.5天后，誘導牙齒發(fā)育的潛能則轉移到牙胚組織的間充質中，此時將牙上皮與其他間充質組織重組不能形成牙齒的結構。而牙間充質與非牙上皮組織重組則能誘導該上皮發(fā)育形成牙齒的結構[15-16]。而且，哺乳動物的牙胚具備獨特的發(fā)育性能。將磨牙牙胚組織解離成單細胞，這些細胞能保持牙向分化的潛能，重新聚合后，能重新啟動牙齒器官的發(fā)育程序，發(fā)育形成組織結構完整的牙齒器官[13]。從時間上，形態(tài)學發(fā)生過程與正常牙齒的發(fā)育明顯出現(xiàn)延遲。發(fā)育延遲的原因主要是在聚合后牙齒的重新發(fā)育過程中，牙上皮細胞和牙間充質細胞出現(xiàn)了分離和聚合的過程。在聚合的組織塊中，牙上皮細胞自發(fā)地與牙間充質細胞分離開來，聚合形成牙上皮組織，然后才重新啟動牙齒發(fā)育的形態(tài)學過程，包括蕾狀期、帽狀期、鐘狀期和終末分化期等，重現(xiàn)了正常的發(fā)育過程。本研究進一步支持了領域中的觀點，即再生的過程是重新發(fā)育的過程。

Fgf8、Noggin和Shh都是牙齒早期發(fā)育過程中在牙上皮中表達的基因。FGF8與牙齒發(fā)育過程中牙間充質中Bax1、Lhx6和Lhx7等多種與模式形成和形態(tài)發(fā)生密切相關的轉錄因子的誘導表達有關[2]。Bmp2，Bmp4和Bmp7等均在牙上皮和釉節(jié)中表達，調控細胞分裂與凋亡，決定牙尖的數(shù)目形成部位，即牙齒的模式。Noggin是 BMP信號的拮抗物，可以調控 BMP信號的強度。SHH是牙胚早期不可缺少的生長因子。E13.5的牙上皮細胞雖然已經失去了誘導牙齒分化的潛能，但仍保持著牙齒發(fā)育的被誘導潛能。我們的研究結果表明，這些牙上皮細胞被解離成單細胞，進而自發(fā)重聚成牙上皮后，仍然表達了牙上皮在牙齒發(fā)育過程所表達的基因，從而導致重現(xiàn)牙齒的正常發(fā)育過程，發(fā)育形成牙齒。因此我們推測，解離的牙上皮細胞在重聚形成牙上皮之前，即使是被解離的單個細胞，仍能保持牙向分化所需的牙齒發(fā)育基因的表達。E13.5的牙間充質細胞具有誘導牙齒發(fā)育的潛能，解離的牙上皮細胞之所以能保持牙齒發(fā)育基因的表達，可能是通過與牙間充質細胞的相互作用，從而維持了牙向分化的潛能。

近年來的研究表明，在成體的牙組織中存在多種干細胞，具有牙向分化的潛能，在特定的誘導條件下能形成牙本質等牙齒組織。但是，這些干細胞都是間充質源性的，只能被誘導形成間充質源性的牙組織[17]。牙上皮將發(fā)育形成成釉質細胞層，完成釉質分泌后凋亡，不復存在。因此，無法分離到牙上皮源性的干細胞。在組織工程牙齒的研究中，利用皮膚的表皮干細胞，誘導多潛能干細胞和胚胎干細胞進行牙上皮的誘導分化，是重要的研究內容之一。我們已有的研究證實，利用小鼠的牙間充質的誘導牙齒發(fā)育的潛能，可以將人的皮膚表皮干細胞誘導形成可分泌牙釉質的成釉質細胞[18]。本研究結果表明，解離的牙上皮細胞在重聚和再生過程中保持Fgf8、Noggin和Shh等牙上皮發(fā)育基因表達。這一結果提示我們，在利用干細胞進行組織工程牙齒制備的研究中，如果能夠激活牙向分化基因的表達，可誘導干細胞的牙向分化，包括牙上皮的分化。

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Dissociated mouse tooth germ epithelial cells retain the expression of tooth developmental genes during reaggregation process

Xuefeng Hu, Chensheng Lin, Bingmei Wang, Pingping Han, and Yanding Zhang

Key Laboratory of Developmental and Neuro Biology of Fujian Province,College of Life Sciences,Fujian Normal University,Fuzhou350108,China

Received:July 14, 2010;Accepted:September 2, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB944802), National Natural Science Foundation of China(No. 30771132), Fujian Natural Science Foundation (No. 2010J01143), Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education(No. 20093503110001).

Corresponding author:Yanding Zhang. Tel: +86-591-22868218; Fax: +86-591-22868199; E-mail: ydzhang@fjnu.edu.cn

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2010CB944802)，國家自然科學基金 (No. 30771132)，福建省自然科學基金 (No. 2010J01143)，高等學校博士學科點專項科研基金 (No. 20093503110001) 資助。